AV/PI凋亡双染的问题，恳请各位大佬指点，也欢迎各位讨论

zxt2009

各位老师、专家、同道好，
小弟这几天在用ANNEXI V/PI双染检测细胞系凋亡，做了3次了，效果非常不理想，主要问题3个：①正常组检测发现凋亡过多，但是镜下观察细胞状态良好；②AV-FITC染色，细胞分群不明显；③双染细胞AV-FITC分群不明显，现在把自己的操作步骤写出来，希望各位老师、同道能给与指点帮助，也欢迎大家讨论，谢谢。
步骤：
1. 6孔板培养细胞系至处理结束（24h），把细胞上清液收集到5ml管子；
2. 1XPBS 1ml洗细胞1次，PBS收集至5ml管子；
3. 0.25%胰酶（NO EDTA）0.5ml/孔，大致消化3分钟；
4. 用管子里对应的上清终止消化，胰酶加入5ml管子，吹下细胞并转移至5ml管子（吹下细胞的过程，感觉正常组细胞相对贴壁较稳，比模型组和单染组吹次数更多，不知道是不是对正常组有了很大影响，也欢迎大家分享贴壁细胞胰酶消化收集的心得，此外我用的是1ml枪吹，是否应换做200ul枪吹下细胞?）；
5. 2000离心转速，5分钟，沉淀细胞（这个过程不知道2000转速是否过大？我看有的实验协议是300g大约1300-1500转速，有的是500g甚至碧云天说明书提到1000g离心。。。。，大家的经验是什么呢？）
6. 弃掉上清液，加入2%胎牛血清的1X PBS 1ml，不吹打，直接1500离心转速，5分钟，洗涤+沉淀细胞1次；
7. 弃掉上清液，加入195ul Buffer，5ul AV-FITC染液，室温避光15分钟；
8. 补加200ul Buffer，5ul PI染液，冰上放置5分钟，上机；

下面是本次实验图片，只做了AV-FITC单染、阴性对照双染、模型双染（PI单染和空白对照沿用过去实验的数值），本次的问题还有1个，离心、洗涤过程中丢失了细胞，所以AV单染和阴性对照细胞很少，模型组没有丢失细胞，收集数量足够。

下面是本次实验原始文件

最后是自己的反思，AV-FITC染色后细胞不分群，最开始公司技术提示稀释AV-FITC染料5倍后使用，本次是稀释后使用的，比之前稍微有了分群趋势，但仍然不明显，根据论坛倪老师提到的，凋亡双染细胞分群应该很明显，我自己反思是否还是染料浓度过大，有了太多非特异染色？考虑继续稀释染料至10倍再用阴性双染组和单染组试试？

niwanmao

贴壁细胞做Annexin V/PI，是个很大的难题。因为 胰酶消化时，很容易造成PS外翻，造成很多假阳性，导致AV+PI-细胞增多。

所以你的图就显示了这个bug。

那么，是否有解决方案呢？有的，1996年的这篇老文献，就给出了较好的方法：A Novel Assay to Measure Loss of Plasma Membrane Asymmetry During Apoptosis of Adherent Cells in Culture其实很简单，就是在胰酶消化前，先用Annexin V与细胞孵育3分钟（但由于Annexin V的结合依赖钙离子，建议此时可以用缓冲液孵育），然后再收集上清、洗涤，贴壁的部分再进行常规消化、收集，最后集中到一起，染PI。

zxt2009

niwanmao 发表于 2021-7-17 09:24
贴壁细胞做Annexin V/PI，是个很大的难题。因为 胰酶消化时，很容易造成PS外翻，造成很多假阳性，导致AV+PI ...

谢谢倪老师，我详细看了这个文献，似乎这个文献最后的结果并不支持用胰蛋白酶消化，任何胰蛋白酶消化后的结果全部不好，作者用细胞刮刀在收集细胞似乎效果更好。
作者是先用 AV-biotin结合细胞外翻PS，然后刮刀收集，然后再用FITC标记的链霉素结合，然后AV-FTIC探针再染色，显示刮刀效果最好，我试试再说，再次感谢倪老师提供的文献。

zxt2009

niwanmao 发表于 2021-7-17 09:24
贴壁细胞做Annexin V/PI，是个很大的难题。因为 胰酶消化时，很容易造成PS外翻，造成很多假阳性，导致AV+PI ...

倪老师，我尝试了用细胞刮刀收集细胞，然后染色，发现染不上。。。。，我打算换YO-PRO-1试剂，然后用只用0.5%EDTA消化贴壁细胞试试

niwanmao

zxt2009 发表于 2021-7-19 00:05
倪老师，我尝试了用细胞刮刀收集细胞，然后染色，发现染不上。。。。，我打算换YO-PRO-1试剂，然后用只用0 ...

是Annexin V染不上还是PI染不上？

zxt2009

niwanmao 发表于 2021-7-19 07:19
是Annexin V染不上还是PI染不上？

AV，我有一个样上清液有很多飘起来的细胞，收集起来的，结果发现没有凋亡的，好奇怪啊

niwanmao

zxt2009 发表于 2021-7-19 11:12
AV，我有一个样上清液有很多飘起来的细胞，收集起来的，结果发现没有凋亡的，好奇怪啊 ...

binding Buffer用了没？ 还是染色过程中碎了？

zxt2009

niwanmao 发表于 2021-7-19 13:29
binding Buffer用了没？ 还是染色过程中碎了？

用了的，倪老师，我后面在荧光显微镜下做了镜检，AV染色模型组能染上的，正常组是染不上，目前流式机器坏了，过几天我再试试，谢谢您！

345641775

你的细胞太少了 你想看到分群最基础的就是调电压和细胞数，你觉得看不到很有可能是你细胞数不够，你把样品量调10倍就能看到了Pi+ AV+的群了。 但是AV的染色我也遇到了相同的问题，感觉细胞不成团用hisgram看图也是没有明显的阴性阳性分界点 也不成团。感觉是染色没染好的原因 你确定你的protocol是冰上5min？