PMA离子霉素刺激、表染CD19、固定破膜后，CD19测不出来？

shunlifasci

各位老师好，我做的是人外周血分离的原代T-B细胞共培养体系，检测药物处理该体系后胞内因子的变化。
实验步骤：1.Ficoll分离人外周血PBMC，磁珠阴选B细胞、阳选T细胞。2、将分选的B细胞分三管（编号：①②③），①管B细胞培养3d检测表明marker（10%FBS培养，无活化剂），②管B细胞在anti-IgM+CD40L+IL4条件下活化5d，检测胞内因子变化；③管的B细胞先用anti-IgM预处理48h后与T细胞共培养（体系含包被的anti-CD3/CD28），5d后检测T、B细胞胞内因子改变。
②③管检测胞内因子时，用PMA+离子霉素刺激4-6h（加入BFA和莫能菌素）——洗，染色死活—Fc block—染色表面CD19，20min—(ebiosceice试剂)固定破膜液500ul 30min——1ml破膜buffer，500g,5min——染色胞内因子——洗，上机分析。
目前问题：同样的分选后的B细胞，管①染色后分析约85%以上的B细胞，管②管③分析B细胞，仅约个位数。比较了下不同管之间的操作，CD19抗体相同（BD，BB700-CD19），最大差异就是经历PMA刺激和固定破膜操作。
试问：固定破膜对CD19影响这么大？我需要固定破膜后再染色CD19嘛，老师们有这方面经验嘛？

niwanmao

从FSC/SSC的分布看，细胞都碎了。
建议先用样本，在固定破膜步骤上进行好好摸索保证细胞完整的条件，条件摸索熟练了，再做实验样本。

stf1990

FSC-SSC窗跟我染FOXP3的很像，基本破膜以后就是这样。 你zoombie dye窗口活细胞比例很高，好奇你细胞因子结果如何？

345641775

感觉你这个圈门的顺序很奇怪 先去黏连体再找细胞。。。 你不是应该先改变电压看哪些是目标细胞哪些是细胞碎片吗？圈细胞那个FSH SSC的门上机时可以再调调电压

面团胖宝宝

请问楼主最后如何解决的呢？我最近做破膜也是这样，全是细胞碎片

niwanmao

面团胖宝宝 发表于 2022-11-22 20:54
请问楼主最后如何解决的呢？我最近做破膜也是这样，全是细胞碎片

首先，样本质量要保证状态较好。
其次，固定这一步比较重要。
最后，破膜剂的浓度也很关键。

面团胖宝宝

niwanmao 发表于 2022-11-23 10:59
首先，样本质量要保证状态较好。
其次，固定这一步比较重要。
最后，破膜剂的浓度也很关键。 ...

我是用的BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Kit进行破膜，具体操作步骤如下，都是按着说明书的步骤来的，第一次做效果就蛮好，目的细胞群很明显，后来几次做就都是细胞碎片，抗体也标不上
横坐标是CD8-APC，纵坐标是颗粒酶B-PE

niwanmao

面团胖宝宝 发表于 2022-11-23 11:11
我是用的BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Kit进行破膜，具体操作步骤如下，都是按着说 ...

看来是后来的样本本身或者处理上出了什么细节问题。
破膜剂应该是问题不大。

面团胖宝宝

niwanmao 发表于 2022-11-23 12:28
看来是后来的样本本身或者处理上出了什么细节问题。
破膜剂应该是问题不大。 ...

处理步骤都是一样的，老师您觉得固定破膜液从250改为200ul或者破膜时间由20min改为15min能有帮助吗？

niwanmao

面团胖宝宝 发表于 2022-11-23 15:57
处理步骤都是一样的，老师您觉得固定破膜液从250改为200ul或者破膜时间由20min改为15min能有帮助吗？ ...

如果个别样本出了问题，一般都是细节上的问题，建议不要轻易修改步骤中的任何体系，而是仔细回顾一下各个步骤操作的细节。