凋亡检测（BD公司试剂盒FITC-AV/PI）问题咨询

TRYTRYTRY

各位大佬们好，在读研究生一枚，最近做凋亡遇到问题，还请指教，感激不尽！

    1、按我们的建模条件建模后用CCK8测细胞活力，多次验证大概64%左右

    2、流式测凋亡，早期凋亡率很低（抱歉暂且无图），大概2.5-5%

    3、操作流程如下：  
                                 A、建模后，用不含EDTA的胰酶1ml消化贴壁细胞37摄氏度，2min，生理盐水终止反应后用1ml的枪吹打，细胞很容易脱落
                                    （一个6cm 皿细胞约10ˆ6个）。
                                  B、收集各组细胞于15ml离心管中，离心沉淀细胞
                                  C、将试剂盒内10✖️binding buffer 配置成1✖️，取250ul重悬
                                  D、每管取100ul（细胞数约5✖️10^ 5），加入AV、PI染液各5ul，室温避光染15min
                                  E、每管补加1✖️binding buffer 200ul后上机

   4、疑问？  A、我们使用临床上用的生理盐水洗细胞和配置binding buffer，会影响ca2+因此影响AV结合吗？
                    B、之前师兄答辩时，专家建议早凋用7AAD试剂盒，请问7AAD比PI染料更好吗？
                    C、我的总体流程，有哪些地方有明显错误吗？

                    感谢各位老师，非常感谢，感激不尽，希望得到您的帮助、建议、指正。

niwanmao

7-AAD还是PI，不是关键。
关键是缓冲液的稀释，还是建议用PBS配制。
另外，无图无真相，建议还是放图或FCS文件。

TRYTRYTRY

niwanmao 发表于 2021-7-29 12:10
7-AAD还是PI，不是关键。
关键是缓冲液的稀释，还是建议用PBS配制。
另外，无图无真相，建议还是放图或FCS ...

谢谢倪老师的建议，我下次做了后记得补图片

家的感觉

TRYTRYTRY 发表于 2021-7-29 16:08
谢谢倪老师的建议，我下次做了后记得补图片

1、7-aad和PI应该影响不大。
2、一般凋亡检测要收集培养上清，和消化下来的悬液混合后离心收集细胞，特别对于一些处理组样本，细胞会悬浮于培养上清中，说明书上应该也提到了。如果你的模型组有类似情况，会导致凋亡结果偏低。
3、binding buffer配置如果说明书没有说明，还是咨询一下厂家

TRYTRYTRY

家的感觉 发表于 2021-7-29 17:02
1、7-aad和PI应该影响不大。
2、一般凋亡检测要收集培养上清，和消化下来的悬液混合后离心收集细胞，特别 ...

非常感谢老师，我没有注意收集上清这个问题，我下次做的时候改进