组织酶消化

heybibna

我做的是肝脏组织用II型胶原酶消化30min后制成单细胞悬液，用碧云天的盒子PI总是染不上色，大约80%细胞没染上色，问了一下技术说是细胞通透性不好，70%乙醇固定了14个小时，还是染不上色，但是用同样的方法做肌肉组织就能染上色，想请教一下，有什么方法可以增加细胞通透性，染上PI？

niwanmao

你是要做细胞周期？

做细胞周期，你这里的方法应该是有问题的，首先碧云天盒子的PI究竟是不是AV/PI里面的PI，那个浓度非常低，不够，并且不含破膜成份；其次70％的乙醇不是破膜，只能起固定作用。 因此，请参考站内资料：
PI检测细胞周期（乙醇固定，Triton X-100打孔）
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1330-1-1.html
(出处: 流式中文网)

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-6 07:34
你是要做细胞周期？

做细胞周期，你这里的方法应该是有问题的，首先碧云天盒子的PI究竟是不是AV/PI里面的P ...

是的老师，我是做细胞周期，碧云天盒子说明书上PI染色液的浓度是20x，但是我用这个盒子做肌肉组织的结果能做出来，因为消化下来细胞状态不是很好，用70的乙醇固定完就会有白色絮状物，所以没用乙醇固定就染色了，结果是下面这样的，就是很奇怪G2期比例是0，不明白是什么原因。还有一个问题，就是消化的时候用了0.25%（含EDTA）的胰酶，这会对结果有一定的影响吗？

niwanmao

heybibna 发表于 2021-8-6 10:45
是的老师，我是做细胞周期，碧云天盒子说明书上PI染色液的浓度是20x，但是我用这个盒子做肌肉组织的结果能 ...

你这个结果也是有问题的，并不是做出来了。
请参考前面给你的protocol做吧。

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-6 13:01
你这个结果也是有问题的，并不是做出来了。
请参考前面给你的protocol做吧。 ...

老师，想问您一下结果具体哪里有问题，因为我现在把所有样本都做了，结果都是类似这样的，有没有可能通过圈门改改善一下结果，或者哪里有问题我能改进一下。

niwanmao

heybibna 发表于 2021-8-7 09:29
老师，想问您一下结果具体哪里有问题，因为我现在把所有样本都做了，结果都是类似这样的，有没有可能通过 ...

原因如下：
1、PE-H/PE-A的粘连体门，你可以去看一下其它地方的图形，从来没有这样画的，也没有这样的分布。
2、假设你这个结果是对的，请问S期为什么是断的，没有S期，细胞是如何到G2/M期的？

综上，你这结果是有问题的。从而推测你的染色步骤是有问题的。

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-7 10:15
原因如下：
1、PE-H/PE-A的粘连体门，你可以去看一下其它地方的图形，从来没有这样画的，也没有这样的分 ...

好的，老师，粘连体那个门是贝克曼仪器工程师教我们这样圈的，我也感觉稍微有点问题，她说把粘连体后面那点散的细胞圈上就会有S期，现在看来结果是不对的，老师我上传一下fcs文件，您能帮忙圈一下吗？

niwanmao

heybibna 发表于 2021-8-7 10:53
好的，老师，粘连体那个门是贝克曼仪器工程师教我们这样圈的，我也感觉稍微有点问题，她说把粘连体后面那 ...

你看，有没有发现问题所在？

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-7 11:13
你看，有没有发现问题所在？

老师，我按着您这个圈门试了一下，其实我那个G0G1后面那个小峰是粘连体，它后面根本没有S和G2期，所以您判断我染色方法有问题，是这样的吧？

niwanmao

heybibna 发表于 2021-8-7 15:21
老师，我按着您这个圈门试了一下，其实我那个G0G1后面那个小峰是粘连体，它后面根本没有S和G2期，所以您判 ...

两种可能性：
1、标本确实没有G2和S期，你做的细胞本身就是静止期的细胞。
2、染色问题。

对于初做细胞周期的FLOWER，我的个人建议是，先用已知细胞周期的样本做，条件做稳定了，再做未知的样本，并且还需要同时混入已知细胞周期的样本做为参照物。