胞内因子检测

汀雅

请教各位老师，为什么同一个细胞，我做了表面标记和胞内标记，两者Th1、Th2、Th17的表达差很多呢？
配色如下：
表面：CD3 PE-Cy7 、CD4 FITC 、CD183 APC 、CD196 BV421
胞内：CD3 PE-Cy7 、CD8 BV510、IFN-γ FITC、IL-4 APC、IL-17A PerCP-Cy5.5

niwanmao

1、表面标记的分群，仅为数量，胞内因子，反映的细胞功能，所以会不一致。因为表面标记归属于某个亚群的，它不一定具备该亚群的功能。
2、胞内是否刺激过？

汀雅

niwanmao 发表于 2021-8-6 13:03
1、表面标记的分群，仅为数量，胞内因子，反映的细胞功能，所以会不一致。因为表面标记归属于某个亚群的， ...

胞内做过刺激的，用PMA+离子霉素+BFA刺激的，刺激了四个小时，然后先标记了表面，再固定破膜，标记的胞内

汀雅

niwanmao 发表于 2021-8-6 13:25
目前看来刺激效果不好。这个条件还是需要继续摸索一下。

老师，我们PMA的浓度是50ng/ml,Ionomycin的浓度是1μg/ml,Brefeldin A的浓度是10μg/ml，想请教以下几个问题：
1.我们这个试剂的浓度合适吗？还需要摸索吗？
2.这三种试剂我们是一起加的，Brefeldin A需要后加吗？
3.我是不是可以延长刺激时间再看一下呢？怎样的表达才算刺激效果好呢？
谢谢老师！

niwanmao

汀雅 发表于 2021-8-6 15:30
老师，我们PMA的浓度是50ng/ml,Ionomycin的浓度是1μg/ml,Brefeldin A的浓度是10μg/ml，想请教以下几个 ...

刺激混合物配方请参考下面的：
Culture medium
2 µg/mL Ionomycin
20 ng/mL PMA
20 µg/mL BFA
2.8 µLl/mL GolgiStop (BD Bioscience)

100ul刺激混合物+100ul细胞悬液，孵育4小时。

参考文献：Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition)

niwanmao

汀雅 发表于 2021-8-6 15:30
老师，我们PMA的浓度是50ng/ml,Ionomycin的浓度是1μg/ml,Brefeldin A的浓度是10μg/ml，想请教以下几个 ...

Sorry，前面没仔细看完所有的图，刚才仔细看了下IFN-g的表达率，发现其实刺激效果是可以的，因为主要向Th1分化了。

汀雅

niwanmao 发表于 2021-8-6 21:55
Sorry，前面没仔细看完所有的图，刚才仔细看了下IFN-g的表达率，发现其实刺激效果是可以的，因为主要向Th ...

好的，谢谢老师，意思是从结果看我们这个表面和胞内的检测没有什么问题是吗

niwanmao

汀雅 发表于 2021-8-9 09:13
好的，谢谢老师，意思是从结果看我们这个表面和胞内的检测没有什么问题是吗 ...

是的。

liuruiluna

很重要的一个疑问，是否加了死活染料？我在图里没有看到死活染料。 刺激会引起细胞死亡，死细胞的被非特异性染色就不规律

汀雅

liuruiluna 发表于 2021-8-10 14:30
很重要的一个疑问，是否加了死活染料？我在图里没有看到死活染料。 刺激会引起细胞死亡，死细胞的被非特异 ...

没有加死活染料，一个是我们标记死活的染料和IL-17A的光冲突了，还有一个是我们感觉活细胞群比较明显，所以没有做，依您看像我上面提问中所附图这样的情况需要标记死活吗？