流式抗体封闭问题请教

风萧易水

我想从小鼠PBMC中用human CD3抗体检测human T细胞，首先要排除human CD3抗体和mouse PBMC的非特异性结合，所以我找了两个抗体，一个是BV510-human CD3 antibody，另一个是BV510-isotype antibody，相当于给CD3抗体做一个的同型对照，我用的清洗buffer是含0.5%的BSA的PBS，一组是没有封闭的，另一组是用1%的鼠血清封闭了30min，结果出来跟没封闭一样，不知道哪里出了问题，各位老师帮忙分析下，谢谢了！

niwanmao

这不是好事吗？以后节省了封闭的费用。

这说明这个抗体与靶细胞的因Fc段非特异性结合水平非常低，可忽略不计。

风萧易水

niwanmao 发表于 2021-8-9 07:31
这不是好事吗？以后节省了封闭的费用。

这说明这个抗体与靶细胞的因Fc段非特异性结合水平非常低，可忽略不 ...

我看到文献里面有很多封闭剂，目前我就试了一种小鼠血清的封闭，靶细胞确实是小鼠的细胞，但是无论是同型对照抗体还是human CD3抗体与细胞孵育以后右边总是会多出来一团细胞，我无法判断这是否合理。我认为的理想情况是CD3+门里面没有细胞。

liuruiluna

这一点点飘出来的点 算不上因为没封闭造成的非特异性。可以忽略不计，真正的CD3+ 分群和比例都很清晰，且稳定

niwanmao

风萧易水 发表于 2021-8-9 15:16
我看到文献里面有很多封闭剂，目前我就试了一种小鼠血清的封闭，靶细胞确实是小鼠的细胞，但是无论是同型 ...

要知道，细胞FSC越大、SSC越大，背景荧光水平也就越高，所以你这样的设门是不可能实现矩形门内低水平，要么用斜向梯形门，可以降低目前的同型或封闭后阴性水平。

15955413540

niwanmao 发表于 2021-8-9 07:31
这不是好事吗？以后节省了封闭的费用。

这说明这个抗体与靶细胞的因Fc段非特异性结合水平非常低，可忽略不 ...

想问一下老师，我之前用的biolegend的封闭剂测人血标本，都还行，结果前段时间换了美天旎的牌子然后有一个目标抗体就非常低甚至跟同型处于同一水平了，所以想问一下老师，这种情况下可以认为是后面那个封闭剂的问题吗

风萧易水

niwanmao 发表于 2021-8-10 14:28
要知道，细胞FSC越大、SSC越大，背景荧光水平也就越高，所以你这样的设门是不可能实现矩形门内低水平，要 ...

好的，我试下，谢谢老师了！

风萧易水

liuruiluna 发表于 2021-8-10 14:16
这一点点飘出来的点 算不上因为没封闭造成的非特异性。可以忽略不计，真正的CD3+ 分群和比例都很清晰，且稳 ...

是的，真正的CD3+群荧光强度很高

我想成大牛

15955413540 发表于 2021-8-10 17:01
想问一下老师，我之前用的biolegend的封闭剂测人血标本，都还行，结果前段时间换了美天旎的牌子然后有一 ...

你应该也考虑一下biolegend的封闭剂是否使你的目标抗体出现假阳性呀？换用Miltenyi封闭剂之后降低了非特异性染色，使假阳性变为阴性。