直标和间标同时标记时的步骤

jingweis530

请教老师两个问题：1.我要检测兔子外周血的CD4/CD25，CD4是直标，CD25是间标，那我操作的步骤应该是直标→裂解红细胞   → 间标。还是........？
                               2.间标的二抗与空白（本身细胞未加任何抗体）对照时，非特异特别高，几乎全部都是阳性，是什么原因？

期盼老师指教，谢谢！

niwanmao

jingweis530 发表于 2011-5-31 14:09

                               
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请教老师两个问题：1.我要检测兔子外周血的CD4/CD25，CD4是直标，CD25是间标，那我操作的步骤应该是直标→ ...

1、我建议是直标抗体和间标一抗先全部加入一起孵育，然后PBS洗涤一次，接下来用100ul PBS重悬，加入间标二抗孵育15分钟，最后裂解红细胞，洗涤。比较重要的是，这里的间标一抗和直标抗体不要选择同源的，例如你的直标抗体选择了小鼠抗兔，那么间标抗体最好选择大鼠抗兔或羊抗兔，这样可以防止二抗结合到直标抗体上去。

2、不知道你说的哪个非特异性荧光强？我们做流式的都喜欢看图说话，建议上图。

jingweis530

谢谢老师的指点，让我少走了很多弯路。问题就出在您说的一抗和直标是同源上，但兔子的抗体较少种类选择，而且已经买了，老师请指点一下可否还有别的方法补救或者别的方法封闭呢？再次感谢老师!

jingweis530

这是一个很好的网站，有空闲或遇到问题我都喜欢上来看看，在这里我学到了很多实际的东西。

niwanmao

jingweis530 发表于 2011-6-3 08:16

                               
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谢谢老师的指点，让我少走了很多弯路。问题就出在您说的一抗和直标是同源上，但兔子的抗体较少种类选择，而 ...

如果是同源的，那么从我个人角度来说，我是建议先间标一抗、二抗按顺序标记完之后，洗涤1－2次，再进行直标一抗标记，最后裂红、洗涤。

jingweis530

谢谢老师，我们按照你的指点做了一次，还是有很高的非特异，就是CD25（间标）阳性很高，可以达到90%，现在不知道该怎么解决，老师还有什么好的主意？焦急等待老师再指点。

niwanmao

jingweis530 发表于 2011-6-7 08:25

                               
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谢谢老师，我们按照你的指点做了一次，还是有很高的非特异，就是CD25（间标）阳性很高，可以达到90%，现在 ...

上午想回答，但忙着，现在回答一下：
1、间标的一抗标记后，二抗标记之前，也需要洗涤1－2次，不知道有没有洗涤过？
2、需确认一下这种高表达是否真的是非特异性染色，建议做一管单独间标、没有直标的管子，做一下对照。

jingweis530

谢谢老师！
我间标的一抗标记后，二抗标记之前，有洗涤1次。我也做了一管单独间标（CD25），没有加直标（CD4），与空白对照和同型对照（两管图形和位置一样），阳性表达率都在90%以上，感觉细胞群是上移到阳性区域里的。在10的3次方位置以上分开有约2%的细胞群。

niwanmao

回复 jingweis530 的帖子

那么我觉得这应该属于正常的偏移，而不是所谓的因操作问题而引起的非特异性染色。
能否把原始文件或者图传上来看看？

jingweis530

可是它是偏移到10的3次方这样高的位置上，有这种可能吗？