检测凋亡线粒体膜电势

maple032023

我想检测凋亡细胞线粒体膜电势的变化.第一次做,经多方询问所以设计了一个protocol,请各位高手帮忙看看.主要试剂:Rhodamine123储备液:1mg/ml (水溶液,-20度避光保存)(想问一下这个保存条件是不是最好?能保存多少年呢?)
               PBS pH7.4
主要步骤:
1. 栽细胞: HeLa cells seed in 60mm dish 过夜培养
2. 加药:加药培养24小时和48小时(这两个时间是药物引发早期凋亡的时间点,但是我看文献上药物也作用24小时以上,但是线粒体膜电势在4个小时左右就降到很低了.所以我药物作用时间应该如何确定呢?)
3.收集细胞,制备PBS细胞悬液1ml,细胞浓度大概:106~2*107
4.加入Rh123储备液,终浓度10mg/ml,水浴避光37度30分钟(这个地方是不是需要隔一定时间摇一摇,不摇细胞会沉淀不能充分接触?)
5.用PBS洗2~3次(我们测调亡和细胞周期都用冰的PBS,不过我又觉得刚刚37度水浴结束用冰PBS是不是温差太大了,会损伤细胞呢?还有这个离心力应该多少g?)
6.1ml PBS悬浮细胞,流式检测.检测的时候用FL-1 通道,不过这个具体参数应该如何设置呢?然后每次应该检测多少个细胞能说明问题呢?

stef1981

Rhodamine123储备液:1mg/ml (水溶液,-20度避光保存)(想问一下这个保存条件是不是最好?能保存多少年呢?)
用了两年了，荧光还是很强
4.加入Rh123储备液,终浓度10mg/ml,水浴避光37度30分钟(这个地方是不是需要隔一定时间摇一摇,不摇细胞会沉淀不能充分接触?)
需要隔一定时间摇一摇
5.用PBS洗2~3次(我们测调亡和细胞周期都用冰的PBS,不过我又觉得刚刚37度水浴结束用冰PBS是不是温差太大了,会损伤细胞呢?还有这个离心力应该多少g?)#
PBS不用放冰箱里，常温保存就行了
6.1ml PBS悬浮细胞,流式检测.检测的时候用FL-1 通道,不过这个具体参数应该如何设置呢?然后每次应该检测多少个细胞能说明问题呢?
没有具体的参数，我看有的老师一半把荧光最弱的调到10的2次方左右，收集10000个细胞

niwanmao

maple032023 发表于 2011-5-31 19:13

                               
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我想检测凋亡细胞线粒体膜电势的变化.第一次做,经多方询问所以设计了一个protocol,请各位高手帮忙看看.主要 ...

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maple032023

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这个protocol我看了,和我的主要区别就是您那个直接用培养基悬浮细胞再加rh123,这步和用PBS悬浮细胞有什么区别吗?

maple032023

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对了,我买的这个rh123是sigma的,5mg,几乎都贴在瓶壁上,根本去不下来,而且那个瓶很小也装不了5ml的水啊,储备液浓度再高点溶解有没有问题啊?比如2mg/ml,然后每次加5微升终浓度10微克每毫升.

maple032023

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这个rh123储备液称取0.38mg溶在甲醇里,这个0.38mg怎么称啊?我们用的一般分析天平都可以读到0.1mg,精确到1mg,而且储备液10ml,只能储存几个月,全浪费了!这个储备液设计不太合理啊

maple032023

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还有一个我不太明白,为什么rh123要和PI搭配进行双染?这个和annexin V/PI双染检测早期凋亡和晚期凋亡是异曲同工吗?

maple032023

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对了,我的是Hela细胞，rh123终浓度10mg/ml是否合适？既能使106个细胞都染色又比较容易洗净。

stef1981

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我们用的终浓度时2微摩尔每毫升

stef1981

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rh123和PI双染的目的是为了排除死细胞，annexin V/PI双染是为了区分早晚凋亡细胞