分子细胞术对体外T细胞耗竭的单细胞多组学分析

niwanmao

T 细胞的异质性显著，许多基因和蛋白质（“标记物”）与细胞成熟、运输、活化和功能相关，这些指标均在免疫反应过程中受到调节，其中不少在肿瘤微环境中发生失调，因此了解它们的表达模式可以提供对疾病生物学机制的理解，以及有关潜在药物靶点的信息。此外，这些标志物的表达模式可能有助于预测疾病、治疗结果或治疗相关的不良事件。

在过去十年中，检测 T 细胞相关标志物的技术发生了巨大的变化。使用批量分析细胞的平台（如微阵列）已经失宠，因为这些方法只能检测大量细胞中的平均表达，无法反映不同细胞之间的表达量差异。单细胞 RNA 测序 (sc-RNAseq) 克服了批量检测的局限性，并且由于可以同时检测大量转录本，故功能强大。然而，转录是一个“嘈杂”的过程，以不规则的时间间隔爆发性转录，甚至在同基因/克隆细胞之间也会发生变化；此外，在单细胞测序分析中捕获 mRNA 也可能效率低下，导致某些细胞/基因信号丢失。因此，仅基于转录分析通常无法清楚地解析细胞群。

然而，当蛋白质和转录物分析相结合时，细胞亚群的区分会大大增强。 分子细胞术（Molecular cytometry） 是一类新的单细胞技术，它将新一代测序 (NGS) 应用于单细胞分析，以同时提供有关细胞转录物和蛋白质的信息。这项技术与流式细胞术一样的地方是，细胞被抗体染色，未结合的抗体在分析前被洗掉。然而，与流式细胞术不同的是，细胞被标记上寡核苷酸标记的抗体（而不是荧光分子），并加载到捕获单个细胞并裂解它们的仪器上。微球通过poly A-oligo dT 相互作用捕获细胞结合抗体相关的mRNA与寡核苷酸。接着，单细胞测序可发现结合的抗体数量和每个结合抗体的靶标（由独特的寡核苷酸标签表示）。此外，可以使用靶向方案或全转录组扩增检测细胞转录本。

这里，Corselli M等人使用分子细胞术来检测与免疫细胞生物学相关的38种蛋白质和399种靶向T细胞转录物的表达，包括 T 细胞耗竭。

分子细胞技术，如 CITE-Seq、REAP-Seq和AbSeq，与其他单细胞技术相比具有许多优势。首先，分子细胞术（也称为基因组细胞术）平台在单细胞水平能检测比荧光或质谱细胞术更多的参数，允许对免疫反应进行细致和全面的分析。其次，荧光流式细胞术都需要减去跨通道重叠的信号（补偿）；这一要求对实验设计和数据分析提出了重大挑战。分子细胞术中使用的寡核苷酸标签是独一无二的，无需跨通道校正。第三，分子细胞术可以比流式细胞术或质谱细胞术更容易地同时检测细胞 mRNA 和蛋白质，从而可以研究蛋白质表达的转录后调控。总之，分子细胞技术提供了更深入的免疫反应分析。

在抗原刺激时，免疫反应由活化的 T 细胞维持和放大，这些 T 细胞表达独特的转录和蛋白质特征。在急性感染的情况下，与 T 细胞活化相关的标志物会驱动关键的细胞过程，包括增殖、募集、归巢、细胞因子分泌和细胞毒性，最终避免免疫损伤。然而，在持续的抗原刺激下，如在慢性病毒感染或癌症的情况下，一些活化的 T 细胞逐渐发展为耗竭表型，其特征是效应功能降低或丧失（例如，细胞因子分泌丧失）和增殖受损。在免疫反应过程中，产生这些耗竭T细胞的程度决定了关键结果，包括病原体是否被清除或生物体是否被慢性感染、肿瘤对检查点抑制疗法的反应潜力，并且可能是使用嵌合抗原受体 (CAR)-T 细胞的过继免疫疗法的结果。

对活化和耗竭T细胞的研究为探索基于分子细胞术的免疫分析的效用提供了独特的环境。此外，大家对 T 细胞被长期刺激时会发生什么的理解仍然存在根本性的缺失，即：
1）T 细胞在慢性刺激期间表现出何种程度的异质性和可塑性？
2）有多少独特的细胞状态（基于转录和蛋白质表达谱）定义了慢性刺激？
3) 哪些标记可以区分活化细胞和耗竭细胞？

体外 CD8+ T 细胞的慢性刺激导致了衰竭的表型和功能特征
作者开发了两种模拟慢性或瞬时T细胞刺激的体外模型。
慢性刺激是通过用重组人 IL-2 (rhIL-2) 和αCD3/CD28微球连续刺激 T 细胞 14 天来实现的。通过用rh-IL2和αCD3/CD28微球刺激T细胞3天，然后在rhIL-2存在下再静息11天来实现瞬时刺激。在不同时间点收集细胞，如图 1A 所示。

为了评估该体外模型系统中的 CD8+ T 细胞是否获得了慢性刺激 T 细胞的表型和功能特征，使用流式细胞术检测了抑制性受体的上调和炎性细胞因子的产生。 CD8+ T 细胞在刺激三天后表现出明显的抑制性受体 CD279 (PD-1) 和 CD223 (LAG-3) 上调（图 1B）。 LAG-3 表达在慢性刺激后一直维持到第 14 天，而某些细胞的 PD-1 逐渐下调。在瞬时刺激条件下，CD8+ T 细胞在第 14 天逐渐失去两种抑制性受体的表达。
接下来，分析了每个时间点和每个实验条件（即慢性与瞬时刺激）的 T 细胞功能。在基线和用 rhIL2/αCD3/CD28 培养三天后，细胞产生 IFNγ和/或 IL2；然而，在第 7 天 - 在慢性和短暂条件下 - 细胞因子表达大大减少（图 1B）。这一观察结果表明，细胞在刺激三天后功能受损。当细胞受到持续刺激（慢性刺激）时，14 天后细胞因子的产生显著受损，而 T 细胞功能在瞬时刺激条件下恢复（图 1B）。
CD4+ T 细胞也观察到了类似的结果（图 1C）。总之，这些数据表明，在体外模型系统中，T细胞耗竭相关表型和功能变化是逐渐诱导出来的。


图 1. 体外慢性刺激时，T细胞耗竭的特征变化。

AbSeq 能够以与流式细胞术相媲美的特异性和分辨率进行蛋白质检测
在确认体外系统模拟了与 T 细胞耗竭相关的标志物表达的动力学之后，接下来进一步比较不同细胞表面蛋白的表达。

图 2A 显示了在整个研究过程中，总 T 细胞（CD8+ 和 CD8-（主要是 CD4+））上的 CD39 表达。在慢性刺激 7 天后，在一小部分细胞中可检测到 CD8+ 和 CD8- T 细胞上的 CD39 表达。刺激 14 天后，CD8+ 和 CD8-T 细胞表达 CD39 的比例增加，CD39 表达水平也随之增加。相比之下，在短暂刺激 14 天后，在任何 T 细胞亚群中均未检测到 CD39 表达。 CD39 表达模式在 AbSeq 和流式细胞术中定性检测结果相似。对于使用两种方法比较检测的 10 种蛋白质中，有7 种蛋白质AbSeq 和流式细胞术得到的比例是相似的（图 2B 和补充图 1A）。此外，标记表达的动力学在流式细胞术和 AbSeq 检测之间相对一致（图 2C 和补充图 1B）；不过这里分析的样本量是有限的。数据表明，与过去的报告一致，AbSeq 方法的灵敏度和特异性通常与流式细胞术相当。


图 2. AbSeq 和流式细胞术使蛋白质检测具有同等的特异性和灵敏度。
(A) 使用流式细胞术（上图）或 AbSeq（下图）对 CD3+ T 细胞的 CD8+ 和 CD8- 亚群中的 CD39 动力学表达进行定性分析。 (B) 在慢性刺激的第 0 天 (D0)、第 3 天 (D3)、第 7 天 (D7 C) 和第 14 天 (D14 C)，CD8+ 细胞表达 PD-1、GITR、TIM-3 和 CD39 的百分比，流式细胞术（红线）或 AbSeq（蓝线）。 (C)在第 0 天 (D0)、第 3 天 (D3)、第 7 天 (D7 C) 和第 14 天 (Day14 C)刺激时， CD8+ T 细胞上 PD-1、GITR、TIM-3 和 CD39 的表达水平。平均荧光强度（红线，左 y 轴）和平均分子计数（蓝线，右 y 轴）分别用于使用流式细胞术和 AbSeq 检测相对抗原表达水平。这种并行分析是对来自同一供体（供体 1）的相同细胞的不同等分样本进行的，这些细胞在指定的时间点冷冻保存。对流式细胞术数据进行下采样，以便在每个时间点分析两个平台上相同数量的细胞（约528-2446 个细胞）。

分子细胞术可以对效应 T 细胞进行更深入的分析
接下来，通过在单细胞水平上同时检测 38 种蛋白质和 399 种 T 细胞特异性基因的表达，对静息 CD8+ T 细胞（第 0 天）进行了多组学分析。

首先，使用 AbSeq识别T 细胞分化状态。 CD45RA 和 CD28 用于定义 CD45RA-CD28+ 中央记忆细胞 (CM)、CD45RA-CD28 效应记忆细胞 (EM) 和 CD45RA+ CD28- RA+效应记忆细胞 (EMRA)。 CD27 还用于区分CD45RA+ CD28+ CD27 高表达的初始细胞 (N)。正如预期的那样，在查看不同的 T 细胞亚群时，定性和定量分析都发现了三个供体之间的差异（图 3A、B）。作者还注意到供体 3 中存在独特的 CD45RA+CD28+CD27low 细胞群，占 CD8+T 细胞的约 12%。


图 3. 新鲜 CD8+ T 细胞成熟状态的深度分析。 (A)区分第 0 天来自 3 个供体的 T 细胞的CD8+ 初始T（蓝色框）、中央记忆T（CM，紫色框）、效应记忆T（EM，黄色框）、RA+效应记忆T（ EMRA，红框）。在供体 3 中检测到独特的 CD45RA+CD28+CD27low 细胞群（CD27low，绿色框）。（B）三个供体的 CD8+ T 细胞亚群的比例。 (C) 选定蛋白质 (Ab) 和三个供体差异表达的基因的单细胞热图（倍数变化≥2，q≤0.05）。每个供体取400个细胞。每列代表来自总 CD8+ 细胞门的单个细胞。事件列根据相对参数表达式以 0-100%（ 最小-最大）伪彩色着色。 (D) CD8+ T 细胞亚群的 t-SNE 可视化，显示了三个供体的不同细胞群，分别具有初始、CM、EM、EMRA 和 CD27low/- 表型。 T-SNE 图是基于 38 种蛋白质和高度分散的基因的表达生成的。

为了进一步定义与供体不同成熟状态相关的蛋白质和转录物，作者进行了差异基因和蛋白质表达谱分析，将初始细胞与 CM、EM 和 EMRA T 细胞进行比较。与已发表的研究结果一致，作者观察到初始细胞中 CD45RA、CD62L、CD197 (CCR7) 蛋白和 SELL、LEF1、IL7R 和 CCR7 转录物水平较高。此外，正如预期的那样，多组学分析显示 EM 和 EMRA 细胞（黄色和红色框）表达高水平的 PD-1 蛋白和编码细胞毒性蛋白 NKG7（NKG7）、颗粒酶（GZMA、GZMB、GZMH）、颗粒溶素的转录物(GNLY) 和穿孔素 (PRF1)。有趣的是，与来自供体 1 和 2 的样本相比，供体 3 的 CD8+ T 细胞表现出更高的效应相关标记表达，这些样本富含显示初始/中央记忆特征的细胞（图 3C）。此外，作者的分析揭示了以前与不同 T 细胞成熟状态无关的新标记物（PIK3IP1、PASK ，以及 CD8+ 初始T细胞中的 TXK 和 CD8+ CM 细胞中的 DUSP1 和 IFNGR1）。

为了更好地明确供体 3 中的 CD45RA+CD28+CD27low 群体性质，作者为每个供体生成了t-SNE图。 tSNE 图中的事件根据细胞的成熟状态进行颜色编码，由 CD45RA、CD28 和 CD27 的差异表达定义（图 3D）。供体 3 中的大量 EMRA 细胞形成了一个独特的细胞簇，其中包括 CD27low 细胞（图 3C，底部红色虚线圆圈），表明 CD27low 细胞与 EMRA 细胞具有相似的基因和蛋白质表达模式，而不是与CD45RA+CD28+ CD27high naïve T 细胞相似，正如预期的那样。

为了测试 CD27low 细胞与 EMRA 的关联是否比初始细胞更密切，作者进行了差异表达分析，比较了 CD27low 和来自供体 3 的初始细胞之间所有检测的转录本和蛋白质。作者发现CD27low 细胞富含 EMRA 细胞表达的蛋白质和基因，如 PD-1、PRF1、GZMB 和 IFNG。
值得注意的是，在 CD27low 细胞（与初始细胞相比）中检测到的 20 种标记物中的 19 种也在 EMRA 细胞中大量表达。总之，作者的结果表明，仅根据 CD45RA、CD28 和 CD27 的表达可能将 CD27low 细胞错误地归类为初始细胞，实际上这些很可能是能够重新表达CD45RA 和 CD27的EMRA细胞。该分析揭示了多组学（蛋白质和 mRNA）分析在更精确地识别细胞类型和更深入地分析经典 T 细胞表型方面的能力。

分子细胞术鉴定与不同 T 细胞活化模式相关的基因和蛋白质特征
在确认了分子细胞术在详细细胞分析中的作用之后，接下来，作者使用这种方法来研究慢性 T 细胞刺激和耗竭伴随的蛋白质和基因表达随时间变化趋势。

慢性刺激 14 天的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞中的许多转录本和蛋白质均升高（与静息细胞相比），这些指标包括趋化因子 (CCL3)、细胞因子 (IFNg、CSF2)、细胞活化标志物 (CD25)、细胞毒性酶（颗粒溶素、颗粒酶 B）、耗竭标志物（CD357、LAG3）、转录因子（TYMS、UBEC2C 和ZBED2) 和细胞增殖标志物 (PCNA)。

为了找出与 T 细胞活化模式（慢性与瞬时）唯一相关的基因和蛋白质，作者通过将体外活化系统的每个时间点相互比较，对每个供体进行了差异表达分析，图 4B 中的维恩图总结了该分析的结果。


图 4. 与 T 细胞活化相关的常见特征。
(A) CD8+ 细胞簇在慢性刺激第 0 天（红色）、第 3 天（蓝色）、第 7 天和第 14 天（分别为橙色和绿色）和瞬态刺激第 14 天（紫色）的 t-SNE 可视化。 t-SNE 图是基于 38 种蛋白质和高度分散的基因的表达生成的。 (B) 维恩图显示了与未受刺激的细胞相比（第 0 天），在第 3 天、第 7 天慢性刺激（第 7C 天）、第 14 天慢性刺激（D14C）和第 14 天瞬时（D14T）刺激时三个供体共同或唯一上调的基因和蛋白质的数量。

接下来，作者专注于在三个供体中的至少两个中活化后上调 3 倍或更高的基因和蛋白质。这种方法发现了具有独特表达模式的四组基因和蛋白质。第一组（图 5A，红色条）由刺激三天后升高但此后下调的标志物（D3）组成，包括了CD278、CD69、IFNg、IL9 和淋巴毒素 A（LTA）。第二组（图 5A，蓝色）代表在慢性刺激 (D14C) 14 天后升高的标记，包括 TNFSF10、YBX3、CSF2、BIRC3、ENTPD1 和 CD39。第三组标记（图 5A，绿色）在所有刺激时间点均上调，但通常在去除刺激后下调，该组包括可大致分为活化/增殖标记（CD25、CD357、CD54、CD98、CD137、GZMB、IL2Ra、PCNA、TOP2A和TYMS）与抑制/耗竭（CD223、IRF4、LAG3、 LGALS1 和 ZBED2）。第四组（图 5A，紫色）包含在瞬时刺激的细胞中表达上调的标记物。综上所述，作者的分析揭示了与活化持续时间存在差异的独特活化特征。


图 5. 与不同 T 细胞活化模式相关的特征。
(A) 与第 0 天相比，在每个时间点（右 y 轴）表达上调（≥ 三倍，在至少两个供体中；左 y 轴）的标记。刺激三天后唯一上调的标记用红色条表示，而慢性 14 天刺激所特有的标记用蓝色条表示。绿色条表示在长期刺激的细胞中的所有时间点哪些标记物都升高，而紫色条表示与3天刺激/11天静息（瞬态刺激，D14T）条件唯一相关的标记。
(B) 蛋白质 (Ab) 和基因的单细胞热图在第 0 天在所有三个供体中上调，并在细胞活化时下调（倍数变化≥2，q≤0.05）。在每个时间点检测420个细胞的数据。

值得注意的是，作者的分析还发现了一组与所有三个供体的静息细胞选择性相关的基因和蛋白质。这些标记在刺激后下调，然后在刺激去除后部分重新获得。这些标记主要包括了与初始 T 细胞相关的蛋白质和基因（CD45RA、IL7R 及其相应的蛋白质 CD127），以及 DUSP1、FOSB 和 JUN（图 5B）。

分子细胞术揭示了抑制和增殖标记之间的独特关系
为了了解活化或抑制的标志物是否在不同的细胞上表达，或者这些基因和蛋白质是否可以在相同的细胞上共表达，作者使用来自 3 个供体的数据绘制了双变量散点图。在各种标记组合中，那些涉及 LGALS1 和 ZBED2 转录本的标记因其随时间推移而逐渐表达。在基线时，很少有细胞表达 LGALS1（Galectin-1 的 mRNA，一种免疫抑制分子）或增殖标记 TYMS 和 PCNA（图 6A）。在第 3 天，LGALS1 和两种增殖标志物都出现上调，并且可以检测到表达所有可能的标志物组合（即，一个标志物，两个标志物都没有）的细胞（图 6A）。然而，在刺激 7 天后，几乎所有表达 TYMS 或 PCNA 的细胞都共表达了抑制分子 LGALS1，表明这些细胞具有抑制潜力。相反，仅经过三天的刺激，绝大多数表达 TYMS 和 PCNA 的细胞共表达 ZBED2，ZBED2 是一种与 T 细胞功能障碍进展相关的转录因子（图 6B）。三天后，表达 ZBED2 的细胞比例逐渐降低，同时对 PCNA 和 TYMS 呈阳性的细胞比例增加（图 6B）。因此，LGALS1 和 ZBED2 的表达在刺激的第 3-14 天（图 6C）出现相反的改变。


图 6. 抑制和增殖标记表达的组合分析。
双变量散点图图显示了在整个慢性刺激过程中抑制标记 LGALS1 (A) 或 ZBED2 (B) 与增殖标记 TYMS 或 PCNA 之间的关系。 (C) 在整个慢性刺激过程中表达 LGALS1 和 ZBED2 的 CD8+ T 细胞的比例。

比较慢性刺激和瞬时刺激
作者还比较了瞬时刺激（刺激三天，然后静息 11 天）与慢性刺激（持续刺激 14 天）。差异基因/蛋白质分析显示，长期刺激的细胞特定的标记物（与瞬时刺激的细胞相比）比较高，其中包括细胞毒细胞标记物（GZMB、GNLY、CD94、GZMH、TNFSF10）、抑制性标记物（CD39 、LAG3、CD223）、效应功能标记物（CSF2（GMCSF）、CCL3（MIP1α）、IFNg、CCL4（MIP1α））和免疫检查点标记物（CD357、CD137）。相比之下，瞬时刺激的细胞似乎能够在最初的3天刺激后保留（或恢复到）初始样表型（更高水平的 CD45RA、CD28、CD27、CD127 和 IL7R）。 因此，作者在瞬态条件下在第 14 天检测到的细胞是初始细胞，而不是中央记忆细胞。对这些数据的另一种解释不是细胞恢复到初始状态，而是短暂刺激的细胞死亡，留下的大部分初始细胞能够在培养条件下持续存在。

作者接下来使用 Phenograph 来定义瞬态刺激条件下存在的细胞类型/状态。尽管这些细胞主要表达初始细胞的标志物，但仍有一些细胞保留了活化/增殖细胞的特征。例如，一个群体表达 CCL3、CCL4、IFNg 和 CD69，而另一个群体表达 TOP2a、PCNA 和 MKI67（数据未显示）。这些结果揭示了与刺激持续时长相关的异质性，并说明了 AbSeq 和 Phenograph 的组合如何成为细胞分析的强大工具。

有趣的是，当作者分析刺激时间过程中的TCF7 表达时，发现 TCF7+ 和 TCF7- 细胞在刺激 14 天后出现差异。此时，，与 PD1+ TCF7- 细胞相比，PD1+ TCF7+ 细胞高表达：CCR7 和 CD27（初始和中央记忆 T 细胞的特征；分别富集 2.2 和 2.0 倍）、CXCR3（该分子能够增强分化为效应细胞的初始 CD8+ T 细胞；1.6 倍富集）和 CXCL13（被认为促进三级淋巴结构的发育，并可能有助于将 Treg 介导的免疫抑制转化为从头活化适应性免疫反应；7.1 倍富集）。因此，PD1+ TCF7+ 细胞优先表达与维持和放大免疫反应的潜力相关的标志物；这些发现支持最近的报道，即 PD1+ TCF7+的表达意味着可能可以从免疫抑制中拯救出那些快要耗竭的T细胞。

分子细胞术揭示细胞转录与翻译之间的相关性
除了详细的细胞分析外，分子细胞术还提供了一种独特的能力，可以在单细胞水平上关联基因及其相应蛋白质的表达。在这项研究中，作者分析了 23 对基因及其相应蛋白质的这种相关性，并确定动力学变化（在活化过程中）是否相似。在某些情况下，mRNA 和相应的蛋白质在表达动力学方面表现出一致性。例如，ENTPD1 及其相应的蛋白质 CD39 在慢性刺激的第 14 天发生一致上调（图 7A）。类似地，IL7R 及其相应的蛋白质 CD127 在慢性细胞刺激后一致下调。


图 7. 单细胞水平上基因和蛋白质表达之间的相关性。
(A) mRNA 和蛋白质表达的动力学分析。 mRNA 和蛋白质水平以平均分子计数 (MMC)表示，图中为第 0 天 (D0)、第 3 天 (D3)、第 7 天 (D7 C) 和第 14 天慢性刺激的数据。数据表示为三名供者的平均值±标准偏差。 (B) 基因和蛋白质表达的单细胞热图。

对于某些标记，作者观察到 mRNA 和蛋白质表达的不一致模式。例如，第 0 天未受刺激的细胞表达 CD69 mRNA 的基础水平，但不表达蛋白质。在刺激 3 天后，作者观察到 CD69 mRNA 下调，同时 CD69 蛋白上调。刺激 3 天后，CD69 mRNA 和蛋白质均下调。
在某些情况下，能检测到蛋白质表达（并在刺激过程中发生变化），而mRNA 表达少且低（PDCD1 mRNA/PD1 蛋白，图 7A）。总之，蛋白质和 mRNA 表达之间的关系是复杂的，并可看到各种可能的模式（表达比例一致/不一致；表达水平一致/不一致）。这与之前描述 mRNA 转录随机性质的报告一致。

讨论
分子细胞术是一种潜在的强大的免疫监测方法。但是，该技术相对较新。作者在本篇论文中证明了AbSeq（一种新的分子细胞计数技术）可用于免疫监测并证明该方法效果的数据。

首先，AbSeq 与金标准流式细胞术相比，表达各种标记的细胞比例相似。分子细胞术相对于流式细胞术的两个重要优势：（1）所有“抗体”都是寡核苷酸序列，因此它们具有相似的化学和生物物理特性。（2）所有测序的抗体标签的信号、背景和灵敏度都相似，这与流式细胞术不同，流式细胞术中用于检测每种荧光染料的检测器（即光电倍增管）可能有很大差异。（3）在流式细胞术中，对于给定水平的蛋白质表达观察到的信号可能因荧光染料而异，而分子细胞术信号与蛋白质表达相对一致。原则上，通过分子细胞术定量受体水平可能比流式细胞术更直接，尽管将寡核苷酸标记的抗体捕获到微球上的效率和测序深度可能使该应用复杂化。

其次，作者观察了标志物表达的动力学，进一步证实了流式细胞术和分子细胞术之间的一致性。但是，将 23 种 mRNA 的蛋白质和转录物表达进行比较时，可发现转录本和蛋白质表达之间的关系存在很大差异，两者之间不一定一致，经常观察到mRNA上调或存在但没有对应蛋白质表达，反之亦然。在某些情况下，不一致可能反映的是低于检测水平的蛋白质或转录本表达。然而，作者经常发现表型相似的细胞一个具有高水平的转录，而另一个细胞没有。转录本和蛋白质表达之间的关系没有任何明确的规律，转录本和蛋白质表达之间的不一致可能反映了 a) 转录本表达的随机性 或 b) 通过特定于单个蛋白质的机制调节转录本表达。在这两种情况下，很明显转录表达不是蛋白质表达的直接替代物，mRNA 的丰度也与蛋白质无关，这些结果可能会降低单独检测单细胞 RNA 表达（不考虑蛋白质表达）用于免疫监测的平台的价值。

再次，作者对初始、记忆和效应 T 细胞亚群的分析证明了分子细胞术在准确识别细胞群方面的能力，并非常深入地研究了 T 细胞如何随着活化而变化，概括了 T 细胞活化和耗竭的过程每个时间点上调（与静息细胞相比）的蛋白质和基因组。

最后，单细胞分子细胞术提供的高参数数据提供了一种无与伦比的工具，可以更好地定义分子的功能、表达和疾病相关性。

归根结底，分子细胞术的强大之处在于它提供的大数据集，并且抗体方案设计的复杂性更少。

信源：Corselli M, Saksena S, Nakamoto M, Lomas WE 3rd, Taylor I, Chattopadhyay PK. Single cell multiomic analysis of T cell exhaustion in vitro. Cytometry A. 2021 Aug 14. doi: 10.1002/cyto.a.24496. Epub ahead of print. PMID: 34390166.