检测凋亡细胞内ROS的含量

maple032023

我的细胞是HeLa细胞,想检测药物作用后细胞内ROS含量变化.我查看的所有的文献几乎都是使用2’,7’-dichlorofluorescin  diacetate (DCFH-DA)来检测细胞内的活性氧.因此我在Sigma订购了这个化合物. 想请教一下具体的步骤以及注意事项.非常感谢!

niwanmao

参见：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=255

maple032023

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加入探针之后还用不用PBS洗呢?

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-3 21:04

                               
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加入探针之后还用不用PBS洗呢?

不需要洗涤。
因为这个染料本身不会发光，只有当氧自由基把它的醋酸基团去除之后，才会发光。

maple032023

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老师我测细胞内的ROS用H2O2做阳性对照,50uM的H2O2处理20-30分钟可以吗?另外,加了探针后不用PBS洗会不会导致背景过高呢?(因为胞外也有ROS)

maple032023

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还有老师,您这个protocol上CM-H2DCFDA根H2DCFDA有什么区别啊?我就是在sigma买的H2DCFDA http://www.sigmaaldrich.com/cata ... ang=en&N4=D6883|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC,用这个protocol没有问题吧

maple032023

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老师这个链接不对,每次给您链接都不对呢.我买的sigma的2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate  CAS number: 4091-99-0

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-27 12:13

                               
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老师这个链接不对,每次给您链接都不对呢.我买的sigma的2′,7′-Dichlorofluorescin  ...

应该是一样的，invitrogen喜欢叫CM-H2DCFDA，我也不清楚是什么原因。

这东西不需要PBS洗涤的。
http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=114

maple032023

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老师您这个化合物都用什么溶解呢?sigma公司上写: 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate is soluble in organic solvents such as DMSO, ethanol, and DMF at 25 mg/mL.我觉得DMSO不好,因为它具有捕捉活性氧的功能,乙醇又容易挥发.我看有的protocol写用DMF溶解终浓度为5mM,这个可以吗?DMF是指Dimethylformamide 二甲基甲酰胺吧?

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-27 13:03

                               
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老师您这个化合物都用什么溶解呢?sigma公司上写: 2′,7′-Dichlorofluorescin diace ...

用100％纯乙醇