粒系非特异性荧光

vtea

请教站友有关非特异性荧光的问题。抗体相关信息：CD3 Alexa Fluor700(BD)，用于胞内染色（骨髓样本洗涤-溶血-固定-破膜-染色-洗涤-上机）。流式图如下：
目标样本抗体组合：CD45/cCD3/cCD22/MPO






不知道CD3 A700的非特异结合为什么那么强，补偿问题吗？如果不是，如何消除呢？

niwanmao

不应该啊，非特异性也不应该比特异性荧光还强。抗体的货号和克隆号能否提供一下？

vtea

niwanmao 发表于 2021-10-18 20:38
不应该啊，非特异性也不应该比特异性荧光还强。抗体的货号和克隆号能否提供一下？
...

CD3 A700: BD,(cat)557943, (clone)UCHT1
CD22 PE: BD, (cat)652811
MPO FITC: BD,(cat)652821

niwanmao

vtea 发表于 2021-10-19 10:30
CD3 A700: BD,(cat)557943, (clone)UCHT1
CD22 PE: BD, (cat)652811
MPO FITC: BD,(cat)652821

看了原始文件，确实很奇怪，完全违背常理。
有没有试过在别的机器上跑？有没有可能是仪器的通道设置出错了？

vtea

niwanmao 发表于 2021-10-20 13:04
看了原始文件，确实很奇怪，完全违背常理。
有没有试过在别的机器上跑？有没有可能是仪器的通道设置出错 ...

实验室只有Canto II能跑A700通道，其他A700的抗体做出来就没什么问题，的确非常奇怪。打算封闭一下样本，做单染再看一下

niwanmao

vtea 发表于 2021-10-20 13:41
实验室只有Canto II能跑A700通道，其他A700的抗体做出来就没什么问题，的确非常奇怪。打算封闭一下样本， ...

FcR的结果好像从没见到过这么高的。克隆号跟我们平时用的是一致的。
有没有重复过多次？多个样本？

vtea

niwanmao 发表于 2021-10-21 10:22
FcR的结果好像从没见到过这么高的。克隆号跟我们平时用的是一致的。
有没有重复过多次？多个样本？ ...

昨天做了BSA封闭，增加4%PFA固定时间，然后还是有胞内粒系非特异性阳性。做过大概5例样本了，有AML, ALL,正常样本，正常的粒系上都有非特异性阳性，肿瘤来源的一例倒是没有。这个抗体做表面染色粒系上无非特异性荧光。
问了BD技术，说之前有单位反映APC-Cy7 CD3的非特异性结合强，提醒我这些科研试剂可能不适合做胞内。但是具体原因是什么，并没有说明。倪老师有兴趣的话，抗体带给你，帮忙看一下？

niwanmao

vtea 发表于 2021-10-22 08:45
昨天做了BSA封闭，增加4%PFA固定时间，然后还是有胞内粒系非特异性阳性。做过大概5例样本了，有AML, ALL, ...

好的。
等于说是固定破膜后出现的是吧？

vtea

更新一下这次非特异性染色的后续。继本实验室CD3-A700在粒细胞上有非特异染色后（破膜剂，BD 340973 Permealizing solution），送省人民倪老师友情帮测，结果：CD3在粒系无非特异性荧光。
经提醒，可能是破膜剂原因造成的非特异性荧光，咨询后换了BD新的破膜剂（641776 BD intrasure KIT），到货后严格按照说明书操作进行胞内染色，结果粒系依然有非特异性荧光

以上结果表明：某些抗体在某些破膜剂（或溶血素也有可能？）作用下，可能会有非特异性染色，具体原因未知，流式选择抗体和试剂时还是要多多注意防止采坑，如果在流式中文网能有个不好用抗体集锦就好了。