流式测线粒体膜电势

maple032023

第一次测线粒体膜电势,使用rh123染色,检测control与加药12小时组.结果如图所示.请问这个结果能说明我的样品作用了12小时之后导致了线粒体膜电势降低吗?我看别的文献样品处理的都有双峰,我这个怎么只是有峰位移呢?还有我这个时间是作用的效果比较强呢还是比较弱呢?我想要做时间依赖性,是应该增加还是应该减少药物作用时间呢?

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-5 23:04

                               
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可是这个rh123检测膜电位的原理到底是什么啊?难道网上写的这个错了?"罗丹明123（Rho ...

我明白你的困惑了，你所说的这原理我查了下，是很多博客里面写的，其应用都是在光镜观察下。
首先，你需要知道罗丹明123的特性，它可以自由通过细胞膜，而线粒体膜，则需要电位维持才能摄取。
这样就可以解释了，因为光镜检查时，需要对细胞进行固定，所以释放出来的罗丹明123就可以固定在胞浆中，不会漏到胞外，从而在光镜下受荧光激发而被观察到，这样胞浆的荧光自然是增强的。
而在流式细胞术中，我们在用罗丹明123孵育后会进行一次洗涤（见protocol：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=191），这时，凋亡细胞因为线粒体膜电位的下降，把罗丹明123释放到胞浆，这些罗丹明123由于其自由通过细胞膜的特性，会非常顺利的通过细胞膜释放到胞外，洗涤的时候，就把这些罗丹明123都洗去了，所以最后检测到的大部分是那些残留在线粒体内的罗丹明123，自然就降低了。
这样的解释能明白吗？:)

maple032023

好像不对啊,荧光增强是线粒体膜电势增强吗?我看文献上都是药物导致线粒体膜电势崩溃而荧光减弱啊,应该左移.我这个做的有问题吧!可是明明所有的网站上都写着"罗丹明123（Rhodamine 123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂。其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质,荧光强度减弱或消失。而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光",这样看应该是细胞发生调亡时线粒体膜电为降低,rh123释放出线粒体,发出强荧光,那就是说荧光应该增强啊!弄不明白了

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-5 16:38

                               
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好像不对啊,荧光增强是线粒体膜电势增强吗?我看文献上都是药物导致线粒体膜电势崩溃而荧光减弱啊,应该左移. ...

没错，线粒体电位降低，R123荧光增强。你的结果是正确的。
要出现双峰，可以把control和处理组结果叠加即可。
http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/full/147/12/3335/F2

maple032023

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但您看看这篇文献:http://www.sciencedirect.com/sci ... 36&searchtype=a结果部分的这句话"the integrity of the mitochondrial membreane in cells was examined by rhodamine 123 staining, and the decrease in rhodamine 123 fluorescence intensity reflected potential decrease",而且实验结果也是峰位左移.这篇文献是很清楚的说出来,还有很多文献也得到一样的结果的,都是电势降低,荧光减弱.这怎么解释呢?

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-5 19:26

                               
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但您看看这篇文献:http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleListURL&_meth ...

sorry，是我看错了。
前面这篇文章中（http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/full/147/12/3335#F2），线粒体膜电位去极化（即电位降低）是荧光降低，结论当中也是如此写的：In the two yeast species tested under the optimized staining conditions, an increase or decrease in the R value of stained yeast cell suspensions was observed after treatment with hyperpolarizing (substrate of mitochondrial respiration) or depolarizing (ionophores or specific inhibitors of respiration) agents, respectively.
前面我把他们结果图片中的罗丹明浓度当成了药物浓度，所以看上去就是随着浓度增高而荧光强度增高了。难怪刚才总觉得怎么跟以前看到的不太一样。

不知道你使用的是什么药物？是否肯定能造成线粒体膜电位降低的？

maple032023

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可是这个rh123检测膜电位的原理到底是什么啊?难道网上写的这个错了?"罗丹明123（Rhodamine 123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂。其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质,荧光强度减弱或消失。而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光".这个意思明明就是产生调亡膜电位降低荧光增强啊!不然这个原理应该怎么解释呢?我的药物在24小时导致明显的早期凋亡,晚期凋亡也开始增加,并且早期凋亡随着时间增加而增加,所以我觉得必然膜电势要降低的啊!但是我这次测得是12小时,我明天再做24小时和36小时的,看看是不是有变化.不过做了半天试验连原理都没搞清楚,真是惭愧啊!到底是什么原理啊?为什么电势降低荧光也降低啊?

maple032023

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明白了,谢谢老师!

maple032023

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我今天又测了24小时和36小时的线粒体膜电势,如图所示从上到下依次为:control,24小时,36小时.我这次忘了设门,没有把死亡的细胞去除,可能导致前面有杂峰吧.为什么只有control有双峰呢?是不是有问题呢?control和24小时重叠起来没觉得峰位有变化,但是从mean值来看24小时降低了大约30%,而36小时跟24小时持平.这个结果正常吗?另外,与昨天12小时的对比,如果FL-1电压与昨天相同,那么control的峰位不在10-2上,为了保证control峰位在10-2上,我又把电压调小.是应该每次都固定control峰位在10-2上呢?还是固定每次电压恒定呢?

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-6 16:36

                               
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我今天又测了24小时和36小时的线粒体膜电势,如图所示从上到下依次为:control,24小时 ...

这类log模式下获取的数据还是应该使用Geo mean，而不是mean值，至于为什么，请参见：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=799

所以，你这批数据的确是没什么明显区别。至于原因，我觉得你要从以下几个方面找：
1、孵育后是否已充分用PBS洗涤？
2、你使用的药物是否肯定会造成线粒体膜电位降低？
……

至于获取电压是否固定，我觉得无所谓。