求助rh123检测线粒体膜电势

maple032023

我的药物在24小时就可以引起明显的调亡,可是用流式测rh123染色线粒体膜电势总是荧光增强,所以我想用荧光显微镜先看一看.学长给了我一个coverglass-bottom dish,说在上面栽细胞可以直接看细胞形态.我想问一下,染色之后洗涤的时候用PBS加进去晃一晃,然后再吸出去这样清洗几次,能把coverglass下面的细胞里的rh12洗干净吗?这种dish适合做这种实验吗?(个人认为本身不发光的染料比较适合)

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-14 09:50

                               
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我的药物在24小时就可以引起明显的调亡,可是用流式测rh123染色线粒体膜电势总是荧光增强,所以我想用荧光显 ...

1、在上一个问题中已经给你了一篇文章链接，hela细胞的荧光主峰是否增强不管它，最重要的是看它的左侧是否出现一个副峰，这就行了。http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... =2229&fromuid=1
2、通过荧光显微镜是可以的。只要把背景中的罗丹明洗涤干净即可。你的意思是R123本身发光的？R123虽然本身是有颜色的，但那不是荧光，是需要通过激发才发射出荧光的。

maple032023

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主要是我的结果每次都是单峰,我看的文献里有两种结果,一个是双峰,看左侧峰即可.一个是单峰要看峰位移,我的结果是单峰.为了避免不同时间检测结果不稳定,我调整加药时间使收集时间相同,同时测对照和各个加药组.但是我的结果还是荧光增加,随着加药时间增加荧光增加.我也没办法了,我就想先用荧光显微镜看一下.这个怎么制slide我也不太会,学长给我一套coverglass-bottom dish,让我直接在上面栽,然后药物作用,染色,洗涤.但是因为dish上面有一个小的盖玻片,主要观察盖玻片下面的细胞,所以我怕洗涤的时候盖玻片下面残留的rh123洗不净,所以请教一下这个dish是不是适合?

stef1981

我们做出来也是凋亡越多，荧光强度越强

maple032023

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真的啊?我也是,我做了12,24,36小时的,调亡随着时间增加而增加,rh123测膜电势也作了这几个时间点是荧光越来越强.那您最后怎么解决这个问题呢?膜电势应该降低的啊!为什么荧光反而增强了呢?而且我的样品Bax,caspase蛋白表达都增加了,证明线粒体途径参与了调亡啊!真是要急死了,导师天天问我,我现在也不知道怎么回事.查的所有文献都是线粒体膜电势降低荧光降低.不过我的这个药是一个钾离子通道operner的衍生物,对膜电势可能会有一定影响,不过至于是什么影响我没查到相关文献,也不知道具体怎么回事,实验室还没这条件测钾离子通道.

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-14 11:35

                               
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主要是我的结果每次都是单峰,我看的文献里有两种结果,一个是双峰,看左侧峰即可.一个 ...

盖玻片不能拿掉吗？hela细胞贴壁的，如果能拿掉，多洗几次就问题不大了。

看看有哪位网友用过这个glass bottom dish的，来谈谈经验！！！

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-14 13:03

                               
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真的啊?我也是,我做了12,24,36小时的,调亡随着时间增加而增加,rh123测膜电势 ...

有必要可以试试JC－1.

maple032023

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人家就特意的,把一个盖玻片弄在dish的底部,这样不用制板和固定直接放在荧光显微镜下就可以看,看着挺先进的.其实我就想步骤都一样,就是在上流式之前弄点出来在荧光显微镜下看看,到底是背景的问题,还是就是我的药物使荧光增加.可是人家说制板还得固定什么的,我想有那么费劲吗?直接弄点细胞悬液放在slide上,盖上盖玻片不就完了?用得着固定什么的吗?

maple032023

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我当时没买那个,都说rh123非常好做,还便宜,正好sigma还有,我就直接买了!老师也不会再给我买了啊!

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-14 15:24

                               
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人家就特意的,把一个盖玻片弄在dish的底部,这样不用制板和固定直接放在荧光显微镜下 ...

这东西可以直接实时观察细胞的指标，不需要每次都取出来涂片，说起来呢是先进点。如果自己做涂片是需要固定这一步的，也可以加点血浆之类的东西。
你的结果主要是双峰出不来，如果出来一个双峰，结果也就理想了。