请教流式细胞检测方法开发

yyx

想做一种成体干细胞标志物的流式检测，针对一个蛋白查到了几家抗体，但是不同公司抗体出来结果差别有点大所以怀疑方法学开发过程有问题，但是不知道怎么开发验证才是比较标准的流程，想请教一下各位大佬方法学开发需要提前准备哪些东西，然后一步一步应该做哪些筛选及判断是否正确啊

比如是否要提前准备阳性阴性细胞，然后做抗体滴度，或者做不同比例阳性细胞的检测结果是否符合？等等
说的有点乱，不过确实不知道咋办才能建立一个准确的检测方法

niwanmao

你说的没错，需要有确切阳性和确定阴性的细胞做参照物，以确认抗体是否能特异性地染上。
接着，选择能染上的抗体，用阳性细胞+阴性细胞混合，进行抗体滴定，看哪个抗体哪个浓度能够实现最佳信噪比。

yyx

niwanmao 发表于 2021-12-17 18:41
你说的没错，需要有确切阳性和确定阴性的细胞做参照物，以确认抗体是否能特异性地染上。
接着，选择能染上 ...

谢谢
那这样做一个准确的好像有点复杂
有必要采用其他的蛋白检测手段，比如WB，来进行侧面验证么？
考虑拿到的阳性和阴性细胞，和最终检测的细胞还不完全一样，别在阴阳细胞里边好好的方法，到了目标细胞里边又出岔子了

niwanmao

yyx 发表于 2021-12-22 22:49
谢谢
那这样做一个准确的好像有点复杂
有必要采用其他的蛋白检测手段，比如WB，来进行侧面验证么 ...

宁信WB而不信流式？
只要你保证细胞活力、阻断Fc，检测结果就是可信的，跟细胞种类无关。

yyx

niwanmao 发表于 2021-12-23 07:46
宁信WB而不信流式？
只要你保证细胞活力、阻断Fc，检测结果就是可信的，跟细胞种类无关。 ...

谢谢
曾经遇到过一种情况，尤其是细胞代次比较低的时候，同型就出现类似于阳性结果的峰图。怀疑是细胞状态不好，但是看活率是挺高的。对了，这个是胞内的抗原。不知道胞内抗原是不是有特别之处

niwanmao

yyx 发表于 2021-12-23 16:44
谢谢
曾经遇到过一种情况，尤其是细胞代次比较低的时候，同型就出现类似于阳性结果的峰图。怀疑是细 ...

同型本来就不适合设门的，之前发过很多帖子说明这个概念了。

yyx

niwanmao 发表于 2021-12-23 21:10
同型本来就不适合设门的，之前发过很多帖子说明这个概念了。

谢谢，去看看帖子去

yyx

niwanmao 发表于 2021-12-17 18:41
你说的没错，需要有确切阳性和确定阴性的细胞做参照物，以确认抗体是否能特异性地染上。
接着，选择能染上 ...

对于连续表达的标志物，也采用同样的方法做么，这样的对照好像不好选了

niwanmao

yyx 发表于 2022-2-24 13:12
对于连续表达的标志物，也采用同样的方法做么，这样的对照好像不好选了 ...

连续表达的标记，建议首选生物学阴性对照，即可以确定不表达该标记的同类细胞。
其次是Fc阻断后的同型对照染色。

yyx

niwanmao 发表于 2022-2-24 14:41
连续表达的标记，建议首选生物学阴性对照，即可以确定不表达该标记的同类细胞。
其次是Fc阻断后的同型对 ...

谢谢倪老师，那抗体的滴定咋做？还得用阳性对照吧，这里的阳性对照应该选择不连续表达的细胞了？