小鼠肿瘤的免疫细胞流式标记marker

酱酱的大猪猪

最近要用小鼠原位癌的肿瘤免疫细胞做流式CytoF上机，请问大家我流式上如下标记各个细胞的marker可以吗？
CD4+：CD3（+）、CD4（+）
CTL：CD3（+）、CD8（+）
NK细胞：CD45（+）、NK1.1（+）
Treg：CD4（+）、CD25（+）、FOXP3（+）
MDSC：CD45(+)、CD11b(+)、Ly6G（+）、Ly6C（+）
TAM-1：CD45(+)、CD11b（+）、F4/80（+）、CD206（-）
TAM-2：CD45(+)、CD11b（+）、F4/80（+）、CD206（+）
然后还有一个关键的中性粒细胞标记，但是我发现中性粒细胞跟MDSC表型基本是一样的....请问大家有什么好的办法可以流式上机的时候将它们分开吗，谢谢~

Arles331

emm~亲 你的marker可能要重新设计一下啊~
T CELL        CD45+CD3+
TH CELL        CD45+CD3+CD4+
TC CELL        CD45+CD3+CD8+
Treg        CD45+CD3+CD4+CD25+Foxp3+
DC CELL        CD45+CD11C+MHC II+
NK CELL        CD45+CD3-CD49b+
MDSC        CD45+CD11b+ly6c/ly6g+
M0        CD45+F4/80+CD11b+
M1        CD45+CD11b+F4/80+CD80high
M2        CD45+CD11b+F4/80+CD206high

酱酱的大猪猪

Arles331 发表于 2022-1-12 10:06
emm~亲 你的marker可能要重新设计一下啊~
T CELL        CD45+CD3+
TH CELL        CD45+CD3+CD4+

你好，非常感谢您的帮助，我目前需要做的是肿瘤微环境里的NK、CD8+杀伤性细胞、CD4辅助细胞、MDSC、中性粒、Treg跟TAM细胞；看了您的回答，又自己翻阅了下资料，我想请教几个问题：
1.小鼠NK细胞的流式标记：CD3-、NK1.1+，我看您这用的是CD49b+，我看挺多资料都显示C57小鼠NK细胞的特征性抗体是NK1.1
2.Treg：CD45跟CD3这俩抗体是不是加一个就够了呢？我看有些文献里不需要同时加
3.同样的，CD4跟CD8细胞里CD45跟CD3也是不是加一个就够了呢？
4.TAM细胞的流式标记：请问如果只是筛出TAM细胞来的话，那么他对应的流式标记是不是为CD45+、CD11b+、F4/80+呢？
谢谢您的回答

酱酱的大猪猪

Arles331 发表于 2022-1-12 10:06
emm~亲 你的marker可能要重新设计一下啊~
T CELL        CD45+CD3+
TH CELL        CD45+CD3+CD4+

我仔细看了下，不好意思，确实在肿瘤里的话得加CD45才能尽量避免假阳性结果的出现

Arles331

酱酱的大猪猪 发表于 2022-1-12 10:49
你好，非常感谢您的帮助，我目前需要做的是肿瘤微环境里的NK、CD8+杀伤性细胞、CD4辅助细胞、MDSC、中性 ...

你好，
1. C57小鼠是用NK1.1没错的；CD49b是Balb/c
2. 3. 我是两个抗体都加了的；会有一定的差异，但具体原因是什么我不太清楚，我也只是新手同学；
4. 也许您可以等倪老师来解答

niwanmao

酱酱的大猪猪 发表于 2022-1-12 10:49
你好，非常感谢您的帮助，我目前需要做的是肿瘤微环境里的NK、CD8+杀伤性细胞、CD4辅助细胞、MDSC、中性 ...

C57和NZB小鼠，可用NK1.1（克隆号PK136）。
BALB/c, SJL, AKR, CBA, C3H和A小鼠不表达NK1.1，需用CD49b（克隆号DX5）。

做组织样本，尽量用死活染料+CD45，一起来更好的圈中活的白细胞。

CD45、CD3、CD4、CD8合在一起，可以使得设门更为特异。

TAM，更多的是组织特异性的，表型上似乎不太好分，文献中是用F4/80、CD11b双阳，结合 Ly6C和Ly6G阴性。（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/lab ... PMC5024544/#S2title）

酱酱的大猪猪

Arles331 发表于 2022-1-12 10:58
你好，
1. C57小鼠是用NK1.1没错的；CD49b是Balb/c
2. 3. 我是两个抗体都加了的；会有一定的差异，但具体 ...

好哒，谢谢，请问第2、3问题里在流式上机时的差异是指什么呢？能给我讲讲嘛，谢谢啦~

酱酱的大猪猪

niwanmao 发表于 2022-1-12 13:48
C57和NZB小鼠，可用NK1.1（克隆号PK136）。
BALB/c, SJL, AKR, CBA, C3H和A小鼠不表达NK1.1，需用CD49b（ ...

好哒，谢谢倪老师，我是取小鼠的原位肿瘤下来进行流式标记的，关于TAM的分型问题，我看有的文献用的是CD208分TAM-1跟TAM-2；对了，还有一个问题想请教倪老师，如果我还要标记中性粒细胞的话，我是不是就会跟MDSC混在一起了？昨天拜读了您的关于MDSC跟中性粒的区分一文，小鼠里确实分不开呢。

niwanmao

酱酱的大猪猪 发表于 2022-1-12 17:49
好哒，谢谢倪老师，我是取小鼠的原位肿瘤下来进行流式标记的，关于TAM的分型问题，我看有的文献用的是CD2 ...

目前的文献，都是通过提取单个核细胞之后，再用表型 11b+Ly6C low Ly6G+找出PMN-MDSC，因为通过密度将高密度中性粒排除在外了，所以相对较好。

但是，最好是进一步有功能实验，可以证实。

Arles331

酱酱的大猪猪 发表于 2022-1-12 17:46
好哒，谢谢，请问第2、3问题里在流式上机时的差异是指什么呢？能给我讲讲嘛，谢谢啦~ ...

最后的细胞计数不一样啊~~