percoll 分离小鼠肿瘤组织中淋巴细胞效果不佳

cczxgysl

请问percoll法富集的效果怎么样？
我先用9份percoll的原液和1份10XPBS配成工作液，然后再分别用70体积和30体积的1X PBS分别稀释工作液成30%和70%浓度的percoll。
离心管先加入70%的percoll，用30%的percoll去重悬细胞，缓慢加到70%的液体上面，比例为1：1。
离心1500转，20min，加速减速为1。
分离效果不加，细胞基本处于两种液体中间，试管底部没有细胞沉淀。想请教大家哪里有问题。

niwanmao

为啥不用Ficoll呢？

我记得Ficoll说明书里面有强调过不能用磷酸盐缓冲液，不知道Percoll的说明书是否有讲过类似的？

其次，有看到过有人用20-50-70的

xeeloij

分离效果不加，细胞基本处于两种液体中间，试管底部没有细胞沉淀。 ----- 中间这层就是TILs鸭，底部的是细胞碎片 & 红细胞，最上面是诸如肿瘤细胞之类的“大细胞”

hnsyryx

niwanmao 发表于 2022-1-13 21:28
为啥不用Ficoll呢？

我记得Ficoll说明书里面有强调过不能用磷酸盐缓冲液，不知道Percoll的说明书是否有讲 ...

倪老师，我也遇到类似的情况。我是用的40%/80%分离小肠上皮内淋巴细胞，淋巴细胞聚集在中间层，但粘连有红细胞。而且回收离心后，根本看不到细胞沉淀，是细胞丢失了吗？困惑。我用的角转子离心机，800g离心10min 回收的细胞，难道应该用水平转子离心机？

niwanmao

hnsyryx 发表于 2022-1-26 08:43
倪老师，我也遇到类似的情况。我是用的40%/80%分离小肠上皮内淋巴细胞，淋巴细胞聚集在中间层，但粘连有 ...

Ficoll会不会容易一些？

瓜瓜999

hnsyryx 发表于 2022-1-26 08:43
倪老师，我也遇到类似的情况。我是用的40%/80%分离小肠上皮内淋巴细胞，淋巴细胞聚集在中间层，但粘连有 ...

我的是肿瘤组织，40/80分离后，取中间层，再离心后pellet很小，请问你解决了吗，谢谢~

niwanmao

瓜瓜999 发表于 2023-9-13 03:45
我的是肿瘤组织，40/80分离后，取中间层，再离心后pellet很小，请问你解决了吗，谢谢~ ...

可参考这篇Protocol《Isolation of Mouse Tumor-Infiltrating Leukocytes by Percoll Gradient Centrifugation》

Bio-protocol892.pdf (381.35 KB, 下载次数: 36)

2023-9-13 08:29 上传

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Isolation of Mouse Tumor-Infiltrating Leukocytes by Percoll Gradient Centrifugation

瓜瓜999

niwanmao 发表于 2023-9-13 08:29
可参考这篇Protocol《Isolation of Mouse Tumor-Infiltrating Leukocytes by Percoll Gradient Centrifug ...

谢谢老师，我们也看到了这个protocol，但是只是选择了40%/80%这两个浓度。 步骤不太一样，而且离心在4度进行。不知道离心温度会不会对leukocytes有影响

niwanmao

瓜瓜999 发表于 2023-9-16 17:21
谢谢老师，我们也看到了这个protocol，但是只是选择了40%/80%这两个浓度。 步骤不太一样，而且离心在4度 ...

离心温度多数情况下影响不会太大。

瓜瓜999

niwanmao 发表于 2023-9-16 22:16
离心温度多数情况下影响不会太大。

谢谢老师~