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了解一下中风的免疫反应动态,如何做好这方面研究?

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 楼主| 发表于 2022-1-16 22:24:38 | 显示全部楼层 |阅读模式

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急性缺血性中风期间的免疫反应
免疫系统参与急性缺血性中风的所有阶段,从危险因素到组织修复(Malone,2019a)。脑缺血后,垂死的细胞释放DAMP分子(损伤相关的分子模式),激活常驻的小胶质细胞,由此产生促炎环境,加上血脑屏障通透性增加,促进免疫细胞进入梗塞部位。进入大脑的白细胞可分泌胶原酶、明胶酶、活性氧、细胞因子和白三烯,产生进一步的神经毒性。最后,在脑部炎症自限性阶段,免疫反应从中风时的亚急性和慢性炎症转换为结构重塑和功能重组。局部和浸润性免疫细胞也参与了这种重建和修复。

在所有大脑中动脉闭塞 (MCAO) 模型中,中性粒细胞浸润到脑梗塞灶的高峰出现在第 1-3 天之间,巨噬细胞在第 3-7 天之间出现,淋巴细胞则呈逐渐积累趋势。然而,早在缺血后 5 天,永久性 MCAO 中的 T 和 B 细胞数量明显高于短暂性 MCAO (Zhou et al., 2013),并且两者之间小胶质细胞活化和炎症标志物(例如IL-1、TNF-α、IFN-γ和ICAM-1)表达也存在差异。与永久性 MCAO 相比,短暂 MCAO 后 24 小时观察到的浸润白细胞减少 50% ,与梗死面积无关(Chu et al., 2014)。然而,值得注意的是,最近对缺血后免疫细胞脑浸润的系统评价表明,血管闭塞的持续时间(短暂与永久)和位置(近端与远端)都会影响白细胞进入的程度(Beuker 等人, 2021)。尽管啮齿动物和人类之间的血液白细胞组成存在明显差异,但缺血后神经炎症的时间动态具有可比性,与中风后早期的啮齿动物相比,只有巨噬细胞在人类中风病变中的水平相对较低。

总体而言,流式细胞术在量化中风的免疫反应方面可以发挥明显的作用,在检测急性中风后不同时期免疫细胞浸润的微小变化方面,其优于免疫组织化学。

另外,对于使用流式细胞术来研究免疫细胞活化、功能和表型的学者来说,缺血发作的时间应该是首要考虑因素。例如,在常驻小胶质细胞的情况下,活化发生在脑缺血的几分钟内,为在急性期通过流式细胞术分析增殖和细胞内细胞因子染色提供了关键机会(Malone et al,2019b)。另一方面,在缺血后第一周,小胶质细胞中的抗炎“M2”(例如 CD206+)表型逐渐转变为促炎“M1”(例如 CD68+)表型。中风模型和自缺血发作以来的时间的综合影响可能对调节性 T 细胞 (Tregs) 等亚群的数量影响最大。在永久性 MCAO 中,这些细胞可能占缺血后早期浸润的 CD4+ 细胞的 20%(Malone et al,2021)。相反,在短暂的 MCAO 中,大量的 Treg 侵袭可能要到缺血后数周才会发生。

影响中风免疫反应定量的流式细胞术因素
流式细胞术在检测免疫细胞时的变异因素主要是在样本处理、试剂、仪器设置和数据分析方面。有效的中风免疫流式分析不仅依赖于标准抗体方案,还需要仔细和一致的样品制备、明确的染色方案、经过验证的试剂、校准的仪器,以及正确的实验对照(Cossarizza et al,2019)。

染色方案中的所有抗体都应根据细胞类型和测定条件的最优滴定浓度使用。然而,如果使用相同的抗体研究中风患者多个组织中的细胞,则需要重新验证抗体浓度、孵育温度、孵育时间和细胞数量等方面。

在仪器方面,严格的质量控制包括光电倍增管电压、流体稳定性和光谱补偿的优化。

在分析方面,应首先过滤数据中的液流不稳定信号,然后清除粘连体和死细胞。需要适当的对照来确认染色目标的抗体特异性(可以使用不表达感兴趣标记的细胞确认),并加入阻断单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和 B 细胞上的Fc 受体的阻断剂,可减少假阳性,增加感兴趣抗原阳性或阴性的细胞之间的区分。

未染色的样品不足以确定细胞发出的背景自发荧光与“真实”阳性信号之间的差异,于是,许多研究人员再次转向同型对照。然而,同型对照假定所有非特异性染色都是由于抗体的同种型引起的,事实上,同型对照的阳性染色通常是抗体与细胞 FC 受体结合引起,这种相互作用很容易被Fc阻断剂阻断。

在FMO(荧光减一)对照中,加入了实验中除了要分析的抗体之外的所有抗体,这就可以很确切的判断其它抗体通道漏到要分析的抗体通道的荧光水平,在所有多参数染色方案中,应将FMO对照作为金标准。

在细胞因子测定中,由于不可忽略的基础表达,应包括未受刺激的细胞作为附加对照。


总之,流式细胞术和脑缺血临床前动物模型的结合为免疫细胞在中风进展中的多方面作用提供了更广泛和更深入的了解。 然而,在临床前和临床水平上,样品处理、试剂选择、仪器设置、数据分析和结果报告的问题仍然存在。不过随着流式技术的进步,这些问题会逐渐解决。鉴于流式细胞仪在定量免疫细胞比例、表型、细胞因子表达和蛋白质磷酸化方面的多功能性,该技术无疑仍将是研究中风免疫发病机制、评估治疗临床反应和帮助开发的主要手段,帮助免疫疗法的研发,促进中风幸存者的功能恢复。

节选自:Amu S, Malone K. Flow cytometry and stroke: from current methodology to future applications. Neural Regen Res. 2022 Aug;17(8):1748-1750. doi: 10.4103/1673-5374.332138. PMID: 35017430.
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