rh123检测线粒体膜电势用H2O2做阳性对照可以吗

maple032023

我的药物可以导致调亡,但是每次用rh123测膜电势随着作用时间的增加荧光增强,也不知道是我做的方法有问题还是药物本身就是能够增加膜电势.所以我想用一个阳性对照来检测我方法的可靠性.请问各位高手,一般测线立体膜电势都用什么做阳性对照肯定能导致膜电势降低呢?我实验室有H2O2,作为阳性对照可以吗?

leisong12

"There results suggest that the antitumor activity of cromakalim may be due to the activation of ATP-sensitive K+ channels leading to the inhibiton of the intracellular Ca2+ signalling mechanism"  结合你的实验结果, 我可以给你明确的解释: 癌细胞膜表面存在ATP依赖的药物排出泵, 也就是MDR或BRCP2等多药耐药蛋白,罗丹明123是其底物之一, 而这种泵也是钙离子依赖的, 当你用的药物可能是直接或间接的钙离子通道抑制剂, 其直接结果是阻止细胞排出罗丹明,导致细胞染色加深,即流式看到的荧光强度增强. 所以用不用H2O2做阳性对照已经无所谓了, 可能本实验用R123测膜电位有问题,建议换方法吧. 我说的你可以查文献验证的,很多的, 因为我常做这一块比较了解.

maple032023

还有,H2O2作为阳性对照多少浓度刺激多长时间就可以产生比较明显的膜电势降低,适合作为阳性对照的条件?

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-21 14:19

                               
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还有,H2O2作为阳性对照多少浓度刺激多长时间就可以产生比较明显的膜电势降低,适合作为阳性对照的条件? ...

过氧化氢只是一个ROS的阳性对照。
真正想作为线粒体膜电位的阳性对照，就是CCCP，Sigma有的买，配成10μM ：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=zh&N4=C2759|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC

maple032023

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我手里没有,怕老师不给买.而且我就是对我的实验方法是否正确不自信想试试能导致线粒体膜电势降低的药物,现在手头上只有H2O2,文献上都说它能导致线粒体膜电势,想问问有没有人做过,大概多少浓度可以,我就试一下,也不放到文章里作为阳性对照.可以吗

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-21 17:41

                               
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我手里没有,怕老师不给买.而且我就是对我的实验方法是否正确不自信想试试能导致线粒 ...

如果不放在文章里是可以试试。
具体剂量和时间参见：http://www.uphs.upenn.edu/ifem/ins/sorokina-lysosomal%20and%20mitochondrial%20pathways.pdf
50 mM H₂O₂作用15分钟或30分钟、60分钟均可。

maple032023

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老师我做完了,您帮我看看!第一个是control(细胞Rh123直接染色),第二个是H2O2作用1个小时,第三个是我的药物作用24小时. 老师您看这个结果,H2O2 作用可以导致荧光强度降低,即线粒体膜电势降低,证明我的实验方法正确.而我药物作用之后仍然是荧光增加,线粒体膜电势增强,我觉得就应该是药物本身的作用了,不是我的问题了.至于为什么会导致调亡了线粒体膜电势却增加还需要进一步研究了吧.

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-25 21:51

                               
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老师我做完了,您帮我看看!第一个是control(细胞Rh123直接染色),第二个是H2O2作用1个 ...

过氧化氢组的细胞形态如果没有问题，那么结果就可信。
这样的话结果上是需要好好考虑。你的药物是什么？会不会产生FL2通道的自发荧光？

maple032023

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药物母体是Cromakalim,一种钾离子通道opener,在它的特定位置加上苯环之类的取代基，抗癌活性明显提高，没有文献报道说它自发荧光啊。我觉得这个结构也不像啊！但是这个母体对钾离子通道有作用，而且它的抗癌活性之前有人做过，关于机理文献原话是这样写的：“There results suggest that the antitumor activity of cromakalim may be due to the activation of ATP-sensitive K+ channels leading to the inhibiton of the intracellular Ca2+ signalling mechanism”我之前的实验证明我的药物可以通过线粒体途径导致癌细胞调亡，但是导致凋亡的途径很多，各种作用相结合也说不定会对膜电势有影响呢。不过我觉得发文章的时候这个数据还是不能用吧，我实在不知道该怎么解释呢，钾离子通道这个我们又没有条件去测。

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-26 20:52

                               
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药物母体是Cromakalim,一种钾离子通道opener,在它的特定位置加上苯环之类的取代基， ...

看它是不是有自发荧光，可以用一管不加药的细胞、一管加cromakalim培养过的细胞，什么都不染，直接上机检测，看他们之间FL2的荧光是否有差别，就看的出来。