小鼠血液裂红后白细胞分群及单核抗体选择

三三两两小星星

各位老师好。目前本人正进行小鼠血液单核细胞和腹腔巨噬细胞的流式检测，血液单核细胞是通过眼球取血收集在抗凝管内，用成品裂红液裂解后离心得到的白细胞总群；腹腔巨噬细胞是通过腹腔灌洗液收集。做了一段时间单染抗体，血液是CD11b，腹腔是F4/80。现在面临以下几个问题，在浏览论坛内的相关帖子以后有初步的想法，希望各位不吝赐教。感谢！
1.裂红液10倍体积效果不好，反复离心清洗三次才能使沉淀无红。想请问下这个裂红液用量是不够才导致难以清洗干净吗，还是小鼠红细胞较多就是需要反复清洗呢？
2.血液提取的白细胞上机后老师说细胞量太少，一般ep管取300-500微升已经是本人取1月龄小鼠的上限，以前也做过双染，结果是细胞量在双阳的情况下会特别少，才改做单染。但目前结果单染的效果不太好，主群的位置会有移动。这种情况是否只能选择将两个个体的抗凝血液混合在一起上样？
3.流式上机后血液白细胞的图如下，做过很多次重复和野生型鼠的试验，几乎都只有两大群。在论坛内看到有站友说小鼠的血液分群就是不太好，想问问我这个分群是正常的吗，是否有什么问题？
4.现在考虑对两种细胞选择双染的抗体，在浏览本站的帖子和部分文献以后。初步考虑血液单核：CD11b+CD115+；腹腔巨噬细胞：CD11b+F4/80+。另外还看到文献中有一个新抗体CX3CR1，但论坛内讨论的帖子似乎不多。不知是否可行？
再次感谢各位阅读。

niwanmao

1、小鼠红细胞相对人红细胞来说，是会难裂解一些，那么可以再加大红细胞裂解液的体积。如果仍不好，得考虑换裂解液。
2和3、从图上看，这个细胞量应该是可以的，只是你们把信号都分配给了碎片，所以需要在仪器上加大FSC的阈值，将碎片排除掉，这样最后的细胞量就大了。
4、可以试，CX3CR1可参见下帖中的表：
小鼠和人单核、巨噬细胞M1、M2、Kupffer细胞、DC表型汇总
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-8624-1-1.html
(出处: 流式中文网)

三三两两小星星

niwanmao 发表于 2022-2-15 19:35
1、小鼠红细胞相对人红细胞来说，是会难裂解一些，那么可以再加大红细胞裂解液的体积。如果仍不好，得考虑 ...

谢谢老师的回复。之前试过好几个牌子的裂解液，都是刚开封的时候效果最好，4摄氏度保存后效果仍然越来越差，一般裂红效果好碎片也会少。下次试试再增大一些裂红液的体积。再次感谢

scaleus

这是我们做小鼠外周血的FSCxSSC
1.我一般都用20倍裂红，裂5-10分钟，也是会有残留，但感觉没有必要完全裂干净。
2.我们做淋巴细胞，不破膜的话，50μl的血是够够的啦，可能单核细胞比淋巴细胞少但100μ肯定也是够的。300μ的细胞太多了也会影响裂红和结果吧。
3.感觉还是裂红的问题。
4.我没有做过单核细胞，腹腔巨噬细胞用的是CD11b和F4/80

三三两两小星星

scaleus 发表于 2022-2-16 18:50
这是我们做小鼠外周血的FSCxSSC
1.我一般都用20倍裂红，裂5-10分钟，也是会有残留，但感觉没有必要完全裂干 ...

非常感谢站友的经验分享，一直没考虑过可能是红细胞量太多的原因。后续我会尝试下这些抗体，看增大裂红液体积后是否需要减少血液收集量。感谢！

三三两两小星星

反馈一下，最近收集的小鼠血单核细胞和腹腔灌洗液巨噬细胞上机的情况，双染血液单核：CD11b+CD115+；腹腔巨噬细胞：CD11b+F4/80+。CD11b是cy5.5，CD115是PE，F4/80是FITC。本来的预期是单核和巨噬细胞在实验组减少。
【条件】
因为担心双染要分单染的补偿管，样本不知道不够，所以两种细胞，实验组对照组各三只鼠都是混合之后得各一个样，并且各自做了补偿和空白。这次血液增加了裂解液的量，裂红效果确实好一些，三裂三洗只有一点红色沉淀。
【结果】
腹腔灌洗液看起来效果还可以，能够有比较明显的群缺失效果，符合预期。

腹腔灌洗液的，可以看到群缺失，圈门比较符合单染补偿

血液就很奇怪了。
一，只有对照组的空白管看起来有稍微明显的分群，我觉得最多细胞的那群应该是淋巴，但这样淋巴上面似乎隐约有三群，而且不知道为什么，空白管明明是从同一个总样里分出来的，和对照组双染上样的分群却不太像，不知道是取血量太多影响了裂解，还是重悬细胞的时候没有混匀。

血液对照组的空白管和双染

二，PE似乎没有染上，而且每个样好像都没有染上，导致血液只有CD11b的cy5.5染色有效。考虑到这个抗体买了可能三年左右了，是赛默飞的，不知道是不是失效了。PS：之前没有学习到流式抗体需要滴定这个知识，这些抗体都是按推荐浓度1:200加的，染色体系100微升。

单染管

单染管

三，上机的时候老师和我说的，在没有FITC的血液样本里却有了大量该色的表达。问得我也开始怀疑自己，但我确实是有加入CD115抗体动作的印象的。这样血液的样本应该也没法用了。

三三两两小星星

血液对照组.zip (5.47 MB, 下载次数: 1)

2022-3-18 17:12 上传

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源文件

血液实验组.zip (5.23 MB, 下载次数: 2)

2022-3-18 17:12 上传

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niwanmao

三三两两小星星 发表于 2022-3-18 17:06
反馈一下，最近收集的小鼠血单核细胞和腹腔灌洗液巨噬细胞上机的情况，双染血液单核：CD11b+CD115+；腹腔巨 ...

做实验，最不好的习惯，就是加了哪些抗体却不在流式获取时标明，这对于以后发文章时原始数据提供审核，会造成很严重的影响。

而且我们现在帮你看这些原始数据，都看不懂究竟你这管加了哪些抗体，全是FITC、PE等荧光素的名字。

下载了这里的实验组数据，看不出各管之间有什么差别。

ang1994

scaleus 发表于 2022-2-16 18:50
这是我们做小鼠外周血的FSCxSSC
1.我一般都用20倍裂红，裂5-10分钟，也是会有残留，但感觉没有必要完全裂干 ...

老师，您好，我想问下你这是什么小鼠外周血裂红的，用的哪家裂红液啊？我们裂红后，粒细胞那群完全的看不见，不知道是裂红液问题还是小鼠品系的问题？

niwanmao

ang1994 发表于 2022-3-21 15:55
老师，您好，我想问下你这是什么小鼠外周血裂红的，用的哪家裂红液啊？我们裂红后，粒细胞那群完全的看不 ...

氯化铵裂解液用的比较多。