单核细胞门位置？

zhaocn

老师，我的样本是冻存后裂红的人血样本，可能是碎片太多，形状很奇怪，找不准淋巴细胞门和单核细胞门的位置。把B细胞backgating看了下淋巴细胞门的位置应该是正确的，但是T+B+NK只有80%多，是不是混了一些单核细胞进去？但是只染了CD45，CD19，CD3，又看不到单核细胞在哪？那我T、B、NK的比例准确吗？

niwanmao

哪个坐标 是CD3、CD19、CD45？图上没标识

zhaocn

niwanmao 发表于 2022-3-31 19:58
哪个坐标 是CD3、CD19、CD45？图上没标识

老师不好意思，Flowjo的backgating不太好看。backgating右侧第三张横轴是CD45，纵轴是死活染料。第四张横轴是AF700-CD3，纵轴是FITC-CD19。

Climber

FSC/SSC受红细胞碎片影响时我们的方案是给CD45略微加一点threshold来去除碎片，还有就是我们血液裂完红之后我们是不再看死活细胞，因为我们常用的去除死细胞方案sytox系列、live/dead似乎都不可用，我个人比较有疑问的是在CD45+LIVE圈门的上面那群细胞是否是真的死细胞，因为一般死细胞他在BV510通道的荧光强度似乎不应该这么低。以上都是建立在小鼠的血液样本，人的我没有做过。

zhaocn

Climber 发表于 2022-4-1 11:00
FSC/SSC受红细胞碎片影响时我们的方案是给CD45略微加一点threshold来去除碎片，还有就是我们血液裂完红之后 ...

请问：1）然后调整CD45 threshould; 2）为什么说死活方案不可用。感谢回复

Climber

zhaocn 发表于 2022-4-3 14:29
请问：1）然后调整CD45 threshould; 2）为什么说死活方案不可用。感谢回复

我们一般会给CD45加200-500的阈值设定（不同仪器，仅供参考），这样会过滤掉很多红细胞碎片，会让FSC/SSC图更加好看一点。裂红后我们的方案是始终会存在红细胞碎片在其中，就会导致我的sytox无法正常的区分

Climber

其实就是我们裂红的时候裂不干净 残留了很多碎片 这些碎片与死细胞染料结合后会产生大量的信号，因此我们索性不去去除死细胞。下面附上我们近期裂解的小鼠红细胞，即使添加了CD45 的阈值设定，也会保留很多碎片，您的样本似乎红细胞碎片过多了或者裂红效果不佳，一般RBC裂解液裂解之后底部细胞沉淀为淡淡的红色 建议再用PBS之类的洗一下，把碎片去一下。