请问同一株RAW264.7细胞封闭和染色之后有双峰是怎么回事？

Doreadeer

如题，
同一株RAW264.7细胞，所有分组都用2%的多聚甲醛在冰上固定了15min。
未做封闭和染色处理的阴性对照组，是单峰，荧光值基本都在10以内。
根据阴性对照组设了电压，但是其他组，经过封闭和染色以后上机检测，都变成了双峰，同型对照也变成了双峰，而且荧光值能到100或1000....请问这是为什么呀？

封闭是100μL体系，之前试过两种方法：
一种是细胞离心弃上清以后，每管用100μL现配好的封闭液重悬，双峰问题很明显
一种是细胞离心以后先用100μL的流式buffer重悬，然后每管单独加1μL的抗体，双峰反而不明显了....
这两种操作之间为什么会差这么大呀？

目的荧光是偶联的AF647

niwanmao

1、在上此样本之前，是否其它人上过其它阳性样本？液路是否干净？
2、你所用的封闭抗体，具体信息是否可提供一下？
3、FSC/SSC分群如何？

Doreadeer

niwanmao 发表于 2022-4-7 08:46
1、在上此样本之前，是否其它人上过其它阳性样本？液路是否干净？
2、你所用的封闭抗体，具体信息是否可提 ...

1、液路是干净的，同一天没有其他人用过，使用之前也冲了很长时间的管路
2、封闭抗体是Biolegend的TruStain FcX™ PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody，Cat.No.156603

（官网上搜了一下，这个封闭抗体好像本身就有双峰的荧光，会是这个原因吗？但之前其他实验都是用这个抗体封闭的，没有出双峰...这个实验第一次做也没有双峰，从第二次做开始就一直双峰）

3，FSC/SSC只有一个群，调电压的时候大概在（600,600）的坐标位置上，很集中的一个群。从AF647荧光的散点图上反向圈门的时候，两个峰对应的细胞群在FSC/SSC上也都是完全重合的

niwanmao

Doreadeer 发表于 2022-4-7 09:07
1、液路是干净的，同一天没有其他人用过，使用之前也冲了很长时间的管路
2、封闭抗体是Biolegend的TruSta ...

官网上的说明书图片，是封闭之后，染CD90.2的图，所以是双峰的。
从你描述的FSC/SSC的情形来看，只能说发生了理解不了的现象。你后续再重复一下看看。

飞翔

RAW264.7细胞状态怎么样，传代是多少代了，这个细胞特别容易分化

Doreadeer

飞翔 发表于 2022-4-8 16:06
RAW264.7细胞状态怎么样，传代是多少代了，这个细胞特别容易分化

细胞状态是正常的，我们组一直做各种巨噬细胞，一般都很稳定，不会分化，实验前也都镜下看过细胞样子。而且FSC/SSC基本是一致的，偏偏就出来了双峰...

Doreadeer

niwanmao 发表于 2022-4-7 18:37
官网上的说明书图片，是封闭之后，染CD90.2的图，所以是双峰的。
从你描述的FSC/SSC的情形来看，只能说发 ...

重复了有两三次，也换过buffer，改过封闭条件...10的3次方的地方永远有一个峰，真的理解不了了

niwanmao

Doreadeer 发表于 2022-4-9 16:00
重复了有两三次，也换过buffer，改过封闭条件...10的3次方的地方永远有一个峰，真的理解不了了{:zhuakuan ...

既然如此，是否考虑换其它的fc blocking？

飞翔

Doreadeer 发表于 2022-4-9 15:55
细胞状态是正常的，我们组一直做各种巨噬细胞，一般都很稳定，不会分化，实验前也都镜下看过细胞样子。而 ...

之前养过一次，直接分化了，空细胞FSC/SSC，不过荧光就分了两个峰。也可能是封闭问题

Doreadeer

niwanmao 发表于 2022-4-9 19:02
既然如此，是否考虑换其它的fc blocking？

我这两天从同一个孔里收了细胞，做了相同的给药刺激，同时封闭，最后：

一半细胞染了这个实验的抗体（santa公司的抗体，同型对照和目的抗体都是偶联的AF647荧光），结果还是像上图一样，isotype control和目的抗体都是那样的双峰

另一半细胞染了另外的抗体（同型对照和目的抗体都是BD公司的，偶联的是PE荧光）上机测出来的是很稳定的单峰，isotype control荧光值在10，目的抗体荧光值在100，

倪老师，这样的话，是不是说明是染色抗体的问题呢？