请教冻存细胞复苏步骤 用于流式

于倩倩

想复苏一批细胞用于流式检测，请教老师复苏步骤，非常感谢。

niwanmao

于倩倩 发表于 2011-7-7 17:42

                               
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想复苏一批细胞用于流式检测，请教老师复苏步骤，非常感谢。

复苏的步骤都一样的，帮你找了一下，不知道这篇东西你看过没有：

一、细胞复苏的原则

在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

二、细胞复苏的主要操作步骤

（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

（2）迅速放入 38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。

（3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。

三、注意事项

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

vetzcm

复苏细胞时，从液氮中取出后要快速置于37度水浴融化，离心后，转入皿中培养，培养液可以适当提高血清浓度，这样细胞长得好些

chujindong

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不知道你现在细胞复苏是怎么做的？做流式检测是用作表面标记检测还是胞内标记？我知道用一般的细胞复苏方法复苏细胞做表面标记没有问题的，不培养。

dragonhzqsmmu

PBMC的复苏大家有没有好的建议，我们是使用10%的DMSO和90%的胎牛血清配制的冻存液+程序冻存盒冻存的，但是复苏感觉细胞死亡率蛮高的

niwanmao

dragonhzqsmmu 发表于 2011-8-23 00:45

                               
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PBMC的复苏大家有没有好的建议，我们是使用10%的DMSO和90%的胎牛血清配制的冻存液+程序冻存盒冻存的，但是 ...

我以前冻过细胞株，PBMC没冻过，但我是这样考虑的，其实细胞在冻存时也是一种培养过程，只是它的消耗营养的速度非常非常慢。
细胞株和全血冻存时，细胞状态本身就比较好，而且营养符合需求，所以复苏后状态就比较好。
而PBMC本身提取之后受到FICOLL的影响，状态就差，而且多次离心对细胞的状态也有很大影响，冻存时肯定多少会有一点FICOLL残留在里面，所以冻存后再复苏肯定状态大打折扣。所以我认为PBMC冻存只适用于PCR等不需要活细胞的实验，对于流式，本身就可以通过设门选择所需要的细胞，因此我建议还是使用全血冻存。

chilliping

我也有同样的困惑。原来的老板说冻存每管的细胞数量不能超过100milllion。我用100M冻存，细胞数觉得还是太多了，复苏出来死亡将近一半。但是做细胞表面标记抗体还是问题不大。

chujindong

回复 chilliping 的帖子

细胞冻存应该是按细胞数量准备冻存液体积吧，不是按每管多少，据我所知，是不超过10EXP7/ml

chujindong

THAWING PROCEDURE
NOTE: Be sure to wear a full-face shield during the thawing procedure because cryovials containing liquid nitrogen have been known to explode.
1 Remove the cryovials from the liquid nitrogen container to a 37°C water bath. If liquid nitrogen has seeped into the cryovial, loosen the cap slightly to allow the nitrogen gas to escape during thawing.
2 Hold the cryovial in the surface of the water bath with an occasional gentle “flick” during thawing. Do not leave the cryovial unattended during the thawing process. (It is important for cell viability that the cells are thawed and processed quickly - thawing only takes a few seconds). When a small bit of ice remains in the cryovial, transfer the cryovial to the biosafety hood. Dry off the outside of the cryovial and wipe with an alcohol solution before opening the vial to prevent contamination.
3 Quickly transfer the thawed cell suspension from the cryovial to a 15-mL conical centrifuge tube containing 10 mL of chilled Complete RPMI medium (contains 10% fetal bovine serum).
4 Centrifuge at room temperature at 200-400 X g for 10 minutes. Remove the supernatant without disturbing the cell pellet. Wash once with 10 mL of room temperature PBS and centrifuge at room temperature at 200-400 X g for 10 minutes. Gently resuspend the PBMCs in the appropriate medium for the assay to be performed.

chujindong

niwanmao 发表于 2011-8-23 08:35

                               
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我以前冻过细胞株，PBMC没冻过，但我是这样考虑的，其实细胞在冻存时也是一种培养过程，只是它的消耗营养 ...

不知道有没有相关文献。我想可以试试，做个小实验看看。
另一个问题：如果单纯做免疫表型的流式，不牵涉细胞功能，是不是细胞的死活就不那么重要了呢？