如何分离并用流式检测小鼠中枢神经系统小胶质细胞

niwanmao

大量研究表明免疫细胞，特别是巨噬细胞在中枢神经系统(CNS)病理过程中的作用。

中枢神经系统有两种主要的巨噬细胞：(i)小胶质细胞，是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，在胚胎发育过程中来源于卵黄囊前体细胞；(ii)单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)，在疾病期间可以渗透到中枢神经系统，来自骨髓前体细胞。

根据所研究的病理，每个巨噬细胞亚群的作用不同。此外，对于这些巨噬细胞亚群的组织学标志物或区分标准还没有达成共识。

然而，Martin等人通过流式细胞术分析CD11b和CD45标记的表达水平，可以区分出小胶质细胞(CD11b+CD45med)和MDM(CD11b+CD45High)。通过密度梯度离心法和流式细胞术分析可以用来区分这些CNS不同的巨噬细胞亚群，并研究这些细胞表达的几个感兴趣的标记。这有助于进一步了解巨噬细胞在小鼠神经系统疾病模型中的作用，也可以用于评估药物对这些细胞的影响。

我们先来看最终的分析结果，A-C是设门逻辑，分别是排除粘连体、圈单个核细胞区域排除碎片、根据CD11b和CD45标记的表达水平识别小胶质细胞和MDM（D图是同型对照，了解背景）； E-G是对每个巨噬细胞亚群的其他表达标记Tmem119、CX3CR1、CCR2进行了分析，小胶质细胞表达CX3CR1而不表达CCR2标记，Tem119是小胶质细胞的特异性标志物，故很明显，CD11b+CD45med群体是小胶质细胞，而MDM则恰好呈相反的表达模式，所以CD11b+CD45high的群体是MDM。图H是在没有密度梯度离心的情况下，由于存在许多细胞和髓鞘碎片，无法在FSC-A与SSC-A的点图中定义巨噬细胞亚群。图I和图J则对比显示了破膜对FSC和SSC的影响。图K显示的是密度梯度离心后，85-95%的细胞是活的。图L至图N是在单个样本中分离大脑和脊髓细胞后，或单独从脑或脊髓中分离出小胶质细胞的得率情况。最后，图O到图R则显示的是对Tmem119的染色对比，说明必须固定破膜后，才能染上。



详细实验步骤，包括消化液的配方，请参见原文信源：Martin, Elodie et al. “Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry.” Journal of visualized experiments : JoVE ,124 55781. 22 Jun. 2017, doi:10.3791/55781

在流式中文网公众号上，两位站友反馈如下，供大家参考：

NeoJ

请问楼主，CD45+CD11b-的那群细胞可能是什么呢？疑惑……

niwanmao

NeoJ 发表于 2022-4-24 09:46
请问楼主，CD45+CD11b-的那群细胞可能是什么呢？疑惑……

淋巴细胞

facetodog

确定这不是死细胞吗

niwanmao

facetodog 发表于 2022-6-14 09:01
确定这不是死细胞吗

你指的是哪群？

facetodog

niwanmao 发表于 2022-6-14 09:09
你指的是哪群？

红的那群 CD45MED

niwanmao

facetodog 发表于 2022-6-15 09:17
红的那群 CD45MED

可能你是觉得其位于对角线上，是吧？

这个是恰好因为双阳造成这样的分布，实际上isotype可说明问题，如果是死细胞，isotype也会位于相近的位置形成火箭状分布，并且FSC/SSC也可结合起来判断证实其不是死细胞。

woiamtt

请问CD11b+/CD45high和CD11b+/CD45[b]low,到底哪个才是小胶质细胞？我看的文献有的是相反的。

niwanmao

woiamtt 发表于 2022-7-3 11:15
请问CD11b+/CD45high和CD11b+/CD45low,到底哪个才是小胶质细胞？我看的文献有的是相反的。 ...

顶楼帖中其实写了，这两种并不矛盾，一般情况下是low或med，但在炎症状态下，CD45可上调。