流式最简单的技术问题却困扰住了我

tianxiaoqi

最近做单核巨噬细胞marker(这个实验已经做3年，一直都没问题)，最近巨噬细胞细胞的marker(CD14,CD11B,HLADR,CD206)标记后，流式下完全检测不到荧光信号，排除原因：不是流式新手，机器没问题，抗体是新买的，很着急，各位老师帮忙分析一下原因，感谢

闷油瓶

抗体是混合抗体吗？步骤怎么做的

niwanmao

直接指出原因可能很难。 主要是你那边做了哪些探索？有没有用已知阳性样本确认过仪器状态？不一定说新买的就没问题，因为有可能条件未设好。

tianxiaoqi

闷油瓶 发表于 2022-4-23 21:14
抗体是混合抗体吗？步骤怎么做的

抗体有单染的也有双染的，步骤就是最常规的步骤，100ul重悬细胞，大概1million的细胞加5ul抗体(说明书推荐)，冰上或者4度避光孵育15-30min，然后PBS洗两次，400ul重悬上机

tianxiaoqi

niwanmao 发表于 2022-4-24 09:12
直接指出原因可能很难。 主要是你那边做了哪些探索？有没有用已知阳性样本确认过仪器状态？不一定说新买的 ...

谢谢老师，阳性标本测试过，机器是没问题的，我这边主要是看不同诱导条件对巨噬细胞表型的影响，可是目前空白对照组(抗体标记)都没有任何信号，荧光显微镜下也看不到任何荧光，是不是可能就是抗体的问题呢，前提是我试了几管抗体，都不行，感觉抗体不能同时失效呀

niwanmao

tianxiaoqi 发表于 2022-4-24 09:40
谢谢老师，阳性标本测试过，机器是没问题的，我这边主要是看不同诱导条件对巨噬细胞表型的影响，可是目前 ...

阳性做过、仪器条件确认无问题，只能归结为抗体了。
或者条件允许的话，同一管染色后的样本，同时在两台仪器上取，进一步确认。抗体平时避光了吗？

tianxiaoqi

niwanmao 发表于 2022-4-24 19:31
阳性做过、仪器条件确认无问题，只能归结为抗体了。
或者条件允许的话，同一管染色后的样本，同时在两台 ...

抗体的小管是深颜色，就直接放在4度了，没再放到盒子之类的，这会受影响吗，老师

Climber

可能见了鬼了 有没有可能是种属性问题呢，比如说该用human的用成了mouse的呢

tianxiaoqi

Climber 发表于 2022-4-24 21:09
可能见了鬼了 有没有可能是种属性问题呢，比如说该用human的用成了mouse的呢 ...

我确认过了，种属木有问题

tianxiaoqi

niwanmao 发表于 2022-4-24 19:31
阳性做过、仪器条件确认无问题，只能归结为抗体了。
或者条件允许的话，同一管染色后的样本，同时在两台 ...

老师，如果单核细胞培养太久，会不会抗原发生变化呢