流式检测坏死性凋亡（Necroptosis）

niwanmao

坏死性凋亡（Necroptosis）是脊椎动物细胞中发生的程序性细胞死亡过程，是因为感染的病原体抑制了经典凋亡过程。病原体通过其抗capsase活性阻断细胞凋亡，向坏死小体发出信号，通过坏死性凋亡导致细胞快速死亡，从而最小化病原体的传播。其他形式的坏死性细胞死亡，例如由非生理事件引起的胀亡（oncosis），通常导致细胞肿胀而死亡，细胞凋亡则相反，是引起细胞收缩的，而坏死性凋亡则是使得细胞内容物通过质膜受控渗漏。
首先，TNFα通过TNF受体的外在刺激信号传导TNF受体相关死亡结构域（TRADD）的募集，并反过来募集RIPK1。在没有活性半胱天冬酶8的情况下，RIPK1和RIPK3彼此自磷酸化和转磷酸化，导致形成称为坏死小体的微丝状复合物。然后，通过磷酸化激活促坏死蛋白MLKL。MLKL通过插入细胞器和质膜的胆脂膜激活坏死表型，导致细胞内容物排出到细胞外空间，见下图。


细胞的炎症破裂将损伤相关分子模式（DAMPs）释放到细胞外空间。这些DAMP中有许多仍未确定，但是，已知“找到我”和“吃我”DAMP信号将免疫细胞募集到受损/感染的组织中。坏死细胞通过胞饮作用被免疫系统中清除，该过程由巨噬细胞介导。而免疫系统去除凋亡细胞则是通过吞噬作用（phagocytosis）。

许多药物如紫草素（Shikonin）也可诱导坏死性凋亡，见图。



已知Necrostatin预处理后再与紫草素孵育，可抑制紫草素引起的坏死性凋亡，见图。



流式细胞术检测坏死性凋亡
通过使用可固定的死活染料（Zombie NIR）、anti-active-caspasse-3、RIP3、H2AX、PARP等标记，可以通过流式细胞术区分坏死性凋亡、凋亡、坏死以及更细分的调节性细胞死亡方式。

上图是RCD（调节性细胞死亡）分群示意图。a图通过Zombie和casepase-3散点图，分出Live cells（包括早期凋亡）和Dead（包括晚期凋亡）细胞。 b图和c图进一步分出坏死性凋亡（caspase-3−/RIP3高+）、早期或晚期凋亡（Caspase-3+/RIP3−）、RIP1依赖性凋亡（RIP1-APO，Caspase-3+/RIP3+）和双阴性（DN，Caspase-3−/RIP3的−）。然后将这些活细胞群和死细胞群中的每一个亚群继续在H2AX/PARP散点图上进行分析，分出DDR（H2AX+/PARP−）、PARP（H2AX+/PARP+）、parthanatos（H2AX−/PARP+）和QN（H2AX−/PARP−）。


参考文献：D Bergamaschi, A Vossenkaemper, WYJ Lee, P Wang, E Bochukova, G Warnes. Simultaneous polchromatic flow cytometric detection of multiple forms of regulated cell death. Apoptosis, 2019. (DOI: 10.1007/s10495-019-01528-w)