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[磁珠分选] 关于CD154磁珠分选后的纯度、活性问题

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发表于 2022-5-24 22:01:51 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
我的实验需要在外周血PBMC中,通过磁珠分选出154阳性细胞,但这个154阳性细胞比例较少,
日前的实验结果,在约10^7个PBMC中,最后获得阳选细胞约5万个,但上流式后死活染料显示70%以上是死细胞。分选前的样本检测发现活性在98%以上,但我的总体数目较多,这1~2%的死细胞总数加起来也不少,并且都染上了抗体结合上了磁珠,留到了最后。导致最后的目的细胞纯度堪忧。请问又怎样的解决办法吗,对于这个实验,请老师指教!


目前我有想到的解决方法,先用CD4磁珠分选一次(阴选),且154主要也是表达在CD4阳性细胞上,同时结合掉这些死细胞,然后再用154阳选一次。但实施一次后效果也很差,甚至不如直接154分选那次的结果,当然两次独立实验不是一个样本,且在别的文献中似乎也看到过阳选➕阴选的组合实验,所以我这个思路是否正确呢?
提到的文献:Balinas C, Nguyen T, Johnston S, Smith P, Staines D, Marshall-Gradisnik S. Investigation of mast cell toll-like receptor 3 in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis and Systemic Mastocytosis using the novel application of autoMACS magnetic separation and flow cytometry. Asian Pac J Allergy Immunol. 2018 Dec;36(4):257-264. doi: 10.12932/AP-200517-0086. PMID: 29223146.

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发表于 2022-5-25 08:23:42 | 显示全部楼层
CD154,我们以前做过高IgM综合征的患者,记得如果不刺激,应该是染不出来的。你的样本是否未经刺激?如果未刺激,肯定是分不出。
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 楼主| 发表于 2022-5-25 12:46:32 | 显示全部楼层
样本经过结核抗原CFP10和EAST-6刺激,分选前检测能有个百分之3、4,以前用PHA刺激能有50%。
这类细胞少是肯定的,我现在的难点是,最后分选完后的目的细胞中有太多是死细胞。整个淋巴细胞(淋巴群的活性比较良好)都只占总数的10%不到更不谈154+细胞了。

经过刺激后154表达肯定是有的,当然不多,所以过多死细胞留到最后太影响纯度。我想整一个能解决死细胞的法子
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发表于 2022-5-25 14:25:36 | 显示全部楼层
615825824 发表于 2022-5-25 12:46
样本经过结核抗原CFP10和EAST-6刺激,分选前检测能有个百分之3、4,以前用PHA刺激能有50%。
这类细胞少是肯 ...

刺激出来的CD154强度很弱,磁珠分选会有很大的问题。我的建议还是流式分选,既可排除死活,而且对于弱表达的细胞,也会有优势。
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