固定破膜后，没有活细胞了

shiyisyl

各位老师，请教个问题。细胞刺激培养过夜后，分成两份，一份做表染，一份做表染+胞内，为什么胞内染色后前向和侧向图成为了这样？看不到活细胞了呢?  而且感觉live-dead染色也有问题，用的eflour 506染料。
怀疑是固定/破膜步骤有问题。操作如下：
100ul 固定液，20min
200ul渗透液洗两次；
染胞内抗体；
200ul渗透液洗两次；
PBS重悬。
请问有问题吗

niwanmao

shiyisyl 发表于 2022-5-28 19:10
我昨天测试了一下，脾细胞直接只加live-dead染料，1:1000加入，50ul染色体系，依旧分不开。 ...

这个结果是分开了的，只是分得不是特别开，这跟组织样本是有一定关系的。

你可以从步骤上进行优化：
1、把Fc封闭放在死活染色之后，live/dead染色时，体系中不能有蛋白质，所以稀释用的PBS中也不能有BSA。
2、不同稀释浓度的live/dead都试试

niwanmao

1、固定、破膜，会影响FSC和SSC，故减小是正常的。
2、固定、破膜的样本，不知你选择的live/dead是否适合此类样本，染色步骤是如何的？

shiyisyl

niwanmao 发表于 2022-5-28 18:51
1、固定、破膜，会影响FSC和SSC，故减小是正常的。
2、固定、破膜的样本，不知你选择的live/dead是否适合此 ...

倪老师，我的live-dead染料是 efluor 506。 今天看文献，说那个染料要使用前现配，我之前都是和表染抗体一起混匀，冰上放置大概能有1小时左右（此期间开始处理细胞，做Fc封闭等等）。不知道和这个有没有关系，但是我的死活一直都分不开。

染色步骤如下：
细胞Fc 封闭后，加死活、表染抗体，15min； 洗涤1次；固定20min；渗透两次；做胞内染色；渗透两次，PBS重悬。


今天优宁维的技术说Tc图lyphocytes位置没有细胞，可能是细胞状态不好，而且渗透液太强了，可以稍微稀释一下。
我回忆了下本次实验，单细胞处理的时候淋分液没分开，又加了裂红，出现了蓝紫色沉淀，死了一些细胞。
不知道是不是这个问题造成的 Tc 的FSC-SSC改变。

shiyisyl

niwanmao 发表于 2022-5-28 18:51
1、固定、破膜，会影响FSC和SSC，故减小是正常的。
2、固定、破膜的样本，不知你选择的live/dead是否适合此 ...

我昨天测试了一下，脾细胞直接只加live-dead染料，1:1000加入，50ul染色体系，依旧分不开。

shiyisyl

niwanmao 发表于 2022-5-28 15:58
这个结果是分开了的，只是分得不是特别开，这跟组织样本是有一定关系的。

你可以从步骤上进行优化：

倪老师，不同浓度的已经做过测试了。1/1000刚好可以分开live-dead。下次做实验的时候，先染live-dead看看能否区分开，谢谢您！另外，还有个问题，就是live-dead图上，右侧细胞群好像并不像死细胞。请看下图，找了抗体做预实验。发现：CD4+T细胞都位于死细胞群里，CD8+T细胞都位于活细胞群，难道是CD4+T细胞都死了吗？  
有网友告知这两群都是live细胞，但是：
unstained control的位置在live-dead上，确实显示在左侧一群。

碎片细胞在live-dead图上，显示的是最右侧的紫色群，比例相当低，所以，不知道该怎么圈门了

niwanmao

shiyisyl 发表于 2022-5-29 20:09
倪老师，不同浓度的已经做过测试了。1/1000刚好可以分开live-dead。下次做实验的时候，先染live-dead看看 ...

CD8没染上？从结果来看，染色应该是存在问题的。所以live/dead这样的形状，我认为是合理的。
所以后续最主要的还是优化好染色步骤。

shiyisyl

niwanmao 发表于 2022-5-29 20:49
CD8没染上？从结果来看，染色应该是存在问题的。所以live/dead这样的形状，我认为是合理的。
所以后续最 ...

明白您的意思了，谢谢倪老师，我明天试一下。多谢指导

shiyisyl

niwanmao 发表于 2022-5-29 20:49
CD8没染上？从结果来看，染色应该是存在问题的。所以live/dead这样的形状，我认为是合理的。
所以后续最 ...

倪老师，您好，调整染色步骤后，live-dead分群很明显了，谢谢指导！

niwanmao

shiyisyl 发表于 2022-6-2 11:26
倪老师，您好，调整染色步骤后，live-dead分群很明显了，谢谢指导！

有效就好。这样这个问题就形成了闭环，这种问题，对其它站友帮助最大了。