求助TREG细胞的流式检测方法

蹦蹦跳跳

买的FITC-CD4，APC-CD25，PE-FOXP3，做了两次CD25都没染上色，想问下TREG的流式检测步骤，包括细胞内的FOXP3，谢谢！

蹦蹦跳跳

我的具体步骤
1 取全血100UL，加入FITC-CD4 5UL，APC-CD3 5 UL,室温，避光15min
2 pbs洗涤，1200rpm,5min
3FIX&PERM ReagentA 100UL 室温，避光15min
4pbs洗涤，1200rpm,5min
5FIX&PERM ReagentB 100UL 室温，避光15min
6PE-FOXP3  5UL 室温，避光15min
7pbs洗涤，1200rpm,5min
8PBS 500 UL 重悬细胞流式检测
问题：
做了两次总是CD25出问题，第一次是CD25细胞只有一群，没分为两群;今天CD25细胞没染上
两次的共同问题是总觉溶血没完全，最后的细胞悬液是浑浊的，同时做的TH17的细胞悬液是澄清的，搞不明白怎么回事？请求帮助看看步骤有没有问题，谢谢！！！

蹦蹦跳跳

还想请教下我买的是联科生物的FIX&PERM KIT ，里面有AB两剂，可不可用来做TREG的固定剂，破膜，溶血？做TH17效果可以，怎么做TREG就没对？是不是试剂的问题？

niwanmao

蹦蹦跳跳 发表于 2011-7-14 21:46

                               
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还想请教下我买的是联科生物的FIX&PERM KIT ，里面有AB两剂，可不可用来做TREG的固定剂，破膜，溶血？做TH1 ...

Treg检测中的FOXP3是核内抗原，需要用破核膜的破膜剂。联科卖的FIX&PERM套装是破胞膜，所以不适用于FOXP3的检测。

FOXP3的检测步骤见：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=215

鉴于FOXP3难做，建议还是改做CD4＋CD25＋CD127low来鉴定Treg

蹦蹦跳跳

可不可以推荐买什么破核膜的破膜剂？因为抗体已经买好了，现在只有买破膜剂了

niwanmao

蹦蹦跳跳 发表于 2011-7-14 23:26

                               
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可不可以推荐买什么破核膜的破膜剂？因为抗体已经买好了，现在只有买破膜剂了
...

只要是检测FOXP3配套的破膜剂就是了。ebioscience和biolegend都有。其它公司应该也有，只是我没有查过。

chujindong

回复 niwanmao 的帖子

我用的就是BD的TREG kit，是带专门的破膜剂的。

蹦蹦跳跳

我想问下TH17细胞刺激时的莫能霉素终浓度用多大？我做TH17，第一次用全血，第二次用提取的单个核细胞怎么两次结果差别很大，一次百分之零点几，一次百分之30.请教可能的原因？我看文献上报到一般都是百分之几，头都痛死了！还想请教下细胞刺激6小时会不会被污染？造成结果的差别？

niwanmao

蹦蹦跳跳 发表于 2011-7-15 19:29

                               
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我想问下TH17细胞刺激时的莫能霉素终浓度用多大？我做TH17，第一次用全血，第二次用提取的单个核细胞怎么两 ...

请看这里：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... =1061&fromuid=1

蹦蹦跳跳

没说莫能霉素的浓度啊？ 其他问题的还没回答