巨噬细胞加完抗体后消失了

薄乐

小鼠脾来源的巨噬细胞染色，所有染色管包括单标管的FSC-SSC上都没有巨噬细胞群，但是空白管的有。
耗材和抗体都是之前用过的，第一次做出来效果还不错，但是今天完全没有巨细细胞群，想请问各位老师可能是什么原因。

niwanmao

是否后面获取其它管的时候，由于团块堵塞了液路，造成未获取到细胞？

薄乐

niwanmao 发表于 2022-6-24 19:41
是否后面获取其它管的时候，由于团块堵塞了液路，造成未获取到细胞？

倪老师你好，由于不是本人上机的所以不是很清楚上机时的状况。

但是虽然没有巨噬细胞，其他管还是可以看得到碎片和单核细胞（FSC 50K左右有一群），现在唯独只有空白管观察到了巨噬细胞（FSC 100K-150K之间），而且即使是和空白管同一来源的其他管都没有观察到。

之前有思考是不是加抗体吹打或者涡旋造成了细胞损伤，但是我感觉10微枪头吹打和1~2秒的涡旋应该不会对巨噬细胞产生如此大的影响，不知道是否还有其他原因。

niwanmao

薄乐 发表于 2022-6-24 21:32
倪老师你好，由于不是本人上机的所以不是很清楚上机时的状况。

但是虽然没有巨噬细胞，其他管还是可以看 ...

如果是操作造成的，感觉不应该这么巧，只出现在染色管。

你观察一下Time参数的图上，信号稳定性如何？

薄乐

niwanmao 发表于 2022-6-25 07:50
如果是操作造成的，感觉不应该这么巧，只出现在染色管。

你观察一下Time参数的图上，信号稳定性如何？ ...

Time-FSC图上连续性良好，虽然部分管有一些断裂带，但是之后也是均匀分布的信号，似乎没有特别的形态
设置了读到目标数量终止，所以很多管time在10~20期间就终止了。

niwanmao

薄乐 发表于 2022-6-25 11:57
Time-FSC图上连续性良好，虽然部分管有一些断裂带，但是之后也是均匀分布的信号，似乎没有特别的形态
设置 ...

所有管的获取数量也是一致？如果有可能的话，将FCS打个包传上来，可以从获取的数据里面再找找原因。

薄乐

niwanmao 发表于 2022-6-25 14:16
所有管的获取数量也是一致？如果有可能的话，将FCS打个包传上来，可以从获取的数据里面再找找原因。 ...

管内的原始数量在2-4*10^5个细胞，上机时统一设置为读取15000个。
我看了下FCS里记录的上机时间，空白管是最后一个上机的，所以应该也不会是堵塞管路的原因。

打包数据这个有难度，倪老师可以说几种可能性比较大的原因么，非常感谢。

niwanmao

薄乐 发表于 2022-6-27 11:23
管内的原始数量在2-4*10^5个细胞，上机时统一设置为读取15000个。
我看了下FCS里记录的上机时间，空白管 ...

所有文件确实都存在15000个细胞吗？如果是的话，你确认一下不同管的15000个信号分别是什么？如果是因为大量碎片和非特异信号占据了该管，那么可能是获取时的液流发生了异常。

薄乐

niwanmao 发表于 2022-6-27 12:06
所有文件确实都存在15000个细胞吗？如果是的话，你确认一下不同管的15000个信号分别是什么？如果是因为大 ...

是的，只有2管没能收到15000个细胞，稍微圈了一下碎片大概在30-40%。
少数管在碎片的附近就有一个群，有没有可能是加完抗体后细胞都缩小了，导致FSC上他们都挤在了左下角没法很好地分散开（FSC直方图：碎片0~15k有一峰，15k-35k有一峰，35k-60k有一峰）？但如果是这个原因的话，可能是缓冲体系出问题么？但如果是缓冲体系的问题，我又无法解释空白管为什么又可以很好地分开。如果提高读取数量可能能改善么？老师一般都要求我们读10000个，这次15000已经是提升了很多了。

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2022-6-27 15:50 上传

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niwanmao

薄乐 发表于 2022-6-27 13:12
是的，只有2管没能收到15000个细胞，稍微圈了一下碎片大概在30-40%。
少数管在碎片的附近就有一个群，有没 ...

空白管同样这两个图的图形是咋样的？