protein L法检测CAR表达问题

风萧易水

请教各位老师关于protein L检测CAR的问题，我之前用逆转录病毒构建了带CAR基因的稳转细胞系CAR-3T3细胞，想拿这个细胞系去验证protein L法检测CAR表达的实验，于是我购买了金斯瑞的iFlour647-protein L，理论上iFlour647-protein L和CAR-3T3孵育会在APC通道有信号，但是我发现在不带CAR的3T3中也有非特异性结合，我用的洗涤液是自配的含4% BSA的PBS。我之前构建成功这个细胞系是用PE-CD19蛋白检测的，CAR的表达在将近100%，我在想是不是要加一些封闭剂之类的试剂能把这种非特异性的结合减少。

niwanmao

Protein L本身是结合κ轻链部分，理论上和Fc段不会有非特异性结合。

出现这种情况，是否说明Protein L产品的问题？可能得跟金斯瑞的技术支持联系一下。

风萧易水

niwanmao 发表于 2022-7-15 14:03
Protein L本身是结合κ轻链部分，理论上和Fc段不会有非特异性结合。

出现这种情况，是否说明Protein L产品 ...

这个蛋白是昨天刚到的货，我感觉不像是试剂本身的问题，我今天又重复了一次实验，把蛋白的质量梯度又提高了，同时洗涤重悬的次数也增加了，结果和上次的就不太一样了，但是非特异性的结合还是很明显的。

niwanmao

风萧易水 发表于 2022-7-15 17:23
这个蛋白是昨天刚到的货，我感觉不像是试剂本身的问题，我今天又重复了一次实验，把蛋白的质量梯度又提高 ...

分群效果确实没有你前面做的PE-CD19蛋白好。看来现实确实比理论要残酷得多

染色前和染色后，洗涤液只用普通PBS，不要含BSA，另外增大洗涤体积和次数（3次或以上），都是非常关键的点。可以在这方面再优化看看。

风萧易水

niwanmao 发表于 2022-7-16 15:46
分群效果确实没有你前面做的PE-CD19蛋白好。看来现实确实比理论要残酷得多

染色前和染色后，洗涤 ...

我之前也怀疑过是BSA的问题，因为按照文献所述，BSA的用量是4%，后面我再按照您说的试一下哈，谢谢倪老师了。

niwanmao

风萧易水 发表于 2022-7-17 23:08
我之前也怀疑过是BSA的问题，因为按照文献所述，BSA的用量是4%，后面我再按照您说的试一下哈，谢谢倪老师 ...

预祝成功 ！