为什么会存在荧光补偿？如何调节？看图！

niwanmao

流式细胞术的优点是同时可以进行多参数检测，从4色到20多色，快速并且信息量大，然而，不同荧光之间，可能存在的补偿，给很多新手造成了极大的困扰。
荧光之间为什么会存在补偿？以FITC和PE为例，下图中显示的是两者的发射光谱，很明显，两者之间存在很大的重叠，这就意味着FITC发出的光，可能被PE检测器检测到，反之，PE发出的光，也能被FITC检测器检测到：



为了调节补偿，我们需要分别借助FITC单染标本，从PE检测信号中减掉漏过去的FITC荧光，借助PE单染标本，从FITC检测信号中减掉漏过去的PE荧光，最后形成如下图所示的样子，分别使Q1和Q3的FITC MFI相等、使Q4和Q3的 PE MFI相等：




但在实际使用过程中，我们要求尽量接近，不一定要使他们的MFI完全一致。
下面是三幅Diva软件中补偿调节的结果图片，a图代表的是正确补偿，b图代表的是过度补偿，c图代表的是补偿未调节到位，大家可以观察一下绿色和红色框内的数字，体会一下正确进行补偿调节的真谛。

niwanmao

白晶晶2019 发表于 2019-11-18 10:47
倪老师，多色流式是每种荧光素都买CD3的抗体吗？用单参数直方图调节补偿？ ...

是的，只是染的细胞需要是T细胞才行。

mengdecao

“分别使Q1和Q3的MFI相等、使Q4和Q3的MFI相等”－－－是不是有笔误？

niwanmao

mengdecao 发表于 2015-11-5 23:44
“分别使Q1和Q3的MFI相等、使Q4和Q3的MFI相等”－－－是不是有笔误？

少写了两个荧光标记的名称：分别使Q1和Q3的FITC MFI相等、使Q4和Q3的 PE MFI相等

aya9988

倪老师，荧光补偿多久调一次比较好？每次测样之前都要调吗？

niwanmao

aya9988 发表于 2016-4-13 07:23
倪老师，荧光补偿多久调一次比较好？每次测样之前都要调吗？

没有明确要求，关键还是在于仪器性能是否稳定

冰蓝草

老师，可不可以直接修改这个值？还是必须要去荧光补偿那里调？

niwanmao

冰蓝草 发表于 2016-5-26 11:53
老师，可不可以直接修改这个值？还是必须要去荧光补偿那里调？

改荧光强度值？这改不了的，这个median值本来就是一个统计指标，只有通过荧光补偿调节细胞群体的位置才能使它改变。

冰蓝草

niwanmao 发表于 2016-5-26 19:16
改荧光强度值？这改不了的，这个median值本来就是一个统计指标，只有通过荧光补偿调节细胞群体的位置才能 ...

谢谢老师，我试了一下确实改不了，是需要通过荧光补偿来调，真的非常感谢老师，通过看这个median值来调节补偿感觉快多了，以前调的时候总是感觉越调越糊涂，我觉得这个方法对新手特别适用

yuan743561169

老师，不是Median值吗？怎么图上的圈的都是Mean值呢？还要请教一点，那个MFI值尽量一致但不一定完全一致，有没有一个上下幅度的范围呢

niwanmao

yuan743561169 发表于 2016-9-13 16:50
老师，不是Median值吗？怎么图上的圈的都是Mean值呢？还要请教一点，那个MFI值尽量一致但不一定完全一致， ...

图是老外那边转的，可能是有些偏差，一般情况下，如果信号呈正态分布，Median和Geomean是一样的。

Median最好完全一致，实在调不好，我觉得统计学上的上下10％是可以的。