为什么你不应该手动调节您的数据补偿值？

niwanmao

做出正确的流式结果，最重要的一步就是调节补偿。
关于调节补偿，在实验室手册中充斥着大量的传闻和秘技，有些是正确的，但有些可能会导致不正确的补偿，使得数据糟糕透顶。


『补偿就是纠正荧光渗漏的步骤』
荧光渗漏是指一个荧光素发出的荧光波长由于与另一个通道发生重叠，导致荧光漏到另一个通道。荧光渗漏程度可以用数字来表示，用该数字来调节补偿，可纠正显示的数据，使其恢复本来面目。

日复一日言传身教传下来最常见的传闻或技巧就是手工调节补偿。


『手工调节补偿是根据看到的数据调节补偿』
如果你现在的实验本上还写着这一条，马上删除它。
手工调节补偿可能会导致数据过度补偿，导致不正确的结论。最好的方法就是使用大多数流式软件附带的自动补偿算法，是Bagwell and Adam在1993发表在Ann NY Acad Sci 20:167-184上的多色补偿算法（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8494206）。

『自动补偿的关键点』
要成功实现自动补偿，需要遵循以下三个原则：
1、单阳性对照至少需要和样本的阳性强度一样高，越强越好，但是右边界千万不要超出坐标轴最大值。
2、阴性和阳性细胞群的背景荧光应该一致，所以要避免对所有标本的补偿都用同样的阴性对照。
3、调节补偿的颜色应该与实验用的颜色一致。例如Alexa 488虽然检测通道和FITC一样，但不能互相替代调节补偿。

在那些出现补偿问题的案例中，研究者基本上都是犯了以上三个原则的错误。只要遵循以上三个原则，即使补偿看上去不好看，也不要为了好看而再做错误的调整，目前大约有30％的研究者都会手工再去调节补偿矩阵以使图形变得好看。

遵循上面三个原则，你的补偿就是正确的，就能够真正寻找出研究中的问题答案。

椴树

阴性和阳性细胞群的背景荧光应该一致  是什么意思啊？

niwanmao

椴树 发表于 2015-3-17 12:05
阴性和阳性细胞群的背景荧光应该一致  是什么意思啊？

简单地说，就是阳性和阴性细胞是同种来源。例如你标记CD4 fitc、CD8 PE，用小鼠标本的补偿来调节人类标本的补偿，那就不行。

wzr19990923

不应该手动调节补偿吗？和以前接受的观点太不一样了，好像不太能接受啊。在平常的检测中，不同的标本、甚至同一标本不同荧光抗体的标记都会有差异，按照这个观点那就无需补偿了？

niwanmao

wzr19990923 发表于 2015-3-29 19:56
不应该手动调节补偿吗？和以前接受的观点太不一样了，好像不太能接受啊。在平常的检测中，不同的标本、甚至 ...

该观点与临床标本无关。

wzr19990923

吓了一跳，还以为自己一直做错了呢{:soso_e120:}