无需富集，也能用流式直接从血浆中分选出细胞外囊泡

niwanmao

细胞外囊泡（EVs）是由各种细胞类型释放的纳米大小（约30-1000纳米）的脂质包裹颗粒。EVs存在于生物体液中，被认为是疾病检测和监测的有潜力的材料。由于太小，EVs的分离和研究都具有一定的难度。在复杂的生物样品中，其他小颗粒和污染蛋白使得基于EVs的生物标志物的发现和验证变得更加困难。

加拿大的Khanna K等人评估了流式细胞术在纳米尺度范围内分离EV的能力，认为：利用流式细胞术，我们可以从预富集的EV产物中分选，也可以无需任何EV预富集就能直接从血浆中分选出CD9阳性EVs，这些结果证明流式细胞术可以作为分离EVs的一种方法。

方法探索

他们首先测试了流式细胞仪检测和分辨不同尺寸（0.1微米到0.9微米）的荧光聚苯乙烯纳米颗粒的能力，确认了该仪器能够区分这个尺寸范围内的颗粒。

接着，使用GFP标记的小鼠白血病病毒（直径124纳米）作为生物纳米颗粒标准，既分析了缓冲液中的病毒，也将其加入到血浆中以观察是否可以检测到病毒。病毒在背景噪声之上以荧光形式被可靠地检测到。然后对其进行设门和分选，以证明分离生物纳米颗粒的可行性。

为了测试EV分离效果，使用荧光抗CD9抗体对血浆样品中的EV进行免疫标记。检测到并分选了CD9阳性的EV。

对分选的CD9阳性EV进行了专用纳米流式细胞技术特性分析，以验证其分离性。去污剂TritonX-100裂解效果，证实了分离出的EV的脂双层性质。


多参数分选则是通过同时标记CD9和CD41并分选出双阳性事件。


使用纳米颗粒跟踪分析分析了分选EV的尺寸分布，显示了一个大约为100纳米的主峰大小。


总的来说，他们的逐步方法通过优化流式细胞术参数和使用荧光标记，展示了检测、设门和分离100纳米颗粒的能力。通过从类似血浆的复杂生物液体中分离出定义的EV亚群，展示了其实用性。

使用流式细胞术从血浆中分离CD9阳性细胞外囊泡（EVs）的关键步骤

样品制备：

• 收集血浆样本，并通过0.8微米过滤器过滤以去除较大的颗粒。
  

免疫标记：

• 取100微升过滤的血浆。
• 在室温下与荧光标记的抗CD9抗体（如15 ng/mL的CD9-CF405M）一起孵育30分钟。
• 添加PBS使总体积达到300微升。
  

流式细胞术设置：

• 使用针对小颗粒检测进行优化的流式细胞仪（如Astrios EQ）。
• 以前向散射信号为触发器。设置阈值以分出超过背景的EVs。
• 应用荧光标记（CD9-CF405M）来检测EVs。
  

筛选CD9阳性EVs：

• 使用FMO和同型对照来设置分选边界。
• 识别CD9阳性群体并设置分选门。
  

分选：

• 将CD9阳性事件分选到含有PBS的试管中。收集阴性群体作为对照。
• 分选时间可能范围从3到8小时，取决于样本。
  

分选后处理：

• 使用100kD旋转滤器，在2000xg进行离心浓缩EVs。
• 添加BSA以减少EV的损失。
• 使用多种验证手段（如FC、WB、EM、NTA）以确认分离的CD9+ EVs。
  

参考文献：Khanna K, Salmond N, Halvaei S, Johnson A, Williams KC. Separation and isolation of CD9-positive extracellular vesicles from plasma using flow cytometry. Nanoscale Adv. 2023;5(17):4435–4446.