常规流式也可以快速、高通量半定量检测EV

niwanmao

细胞外囊泡（EVs）是一种新型的诊断和预后生物标志物，在中枢神经系统病理学等多种疾病中引起了广泛关注。EVs是细胞通过不同途径释放的，包括质膜脱落的外泌体、内源性的外泌体和凋亡小体。EVs在细胞间通信中起着重要作用，并携带特定于细胞类型和细胞状态的分子载体。其中，膜组分和表面表位以及内部含物如mRNA和miRNA可能作为生物标志物具有重要意义。

最近的证据表明，来自神经元和胶质细胞的脑源性EV可以穿过血脑屏障并出现在循环EV中，可作为神经退行性疾病或脑癌的生物标志物。脑源性EV具有诊断和预后神经退行性疾病和脑肿瘤的潜力，如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化和胶质母细胞瘤。此外，EV相关的生物标志物可以帮助区分具有重叠临床症状的疾病。

人类血浆和血清中循环的EVs代表了来自不同组织和细胞来源的EVs的复杂混合物。大脑来源的EVs相对贡献于整个循环EVs的比例不清楚，预计只占少数和动态部分。

因此，通过神经特异性表位（如L1细胞粘附分子或谷氨酸天冬氨酸转运蛋白）免疫捕获EVs，可以富集神经元EVs或星形胶质细胞来源的EVs。然而，这种策略的特异性和效率存在争议，因为这些表位也存在于非神经EVs或以可溶性形式存在。因此，多参数分析EVs可以改善EV表型分析，并揭示EVs的特征，从而全面评估复杂样品中的大脑来源EVs。

Brahmer A等人在2023年10月6日Cell Commun Signal.杂志上展示了一种基于多重微球的流式技术EV Neuro，可以对EV进行广泛的半定量分析，涵盖了多达37个不同的EV表面表位。基本原理是通过在荧光条形码微球上结合的特异性抗体，对EV进行捕获，接着使用荧光标记的抗体识别真正的EV标记（如CD9、CD63和/或CD81）进行检测。

这种方法只需少量样本，不需要特殊设备，只需使用常规流式细胞仪即可。此外，作者还介绍了一个开源软件工具（多重分析后采集分析软件[MPAPASS]），以实现多重EV数据的高通量质量控制和数据分析。

本研究使用EV Neuro检测方法分析了来自三种不同星形胶质细胞系（LN18、LN229和NCH82）以及原代人星形胶质细胞（HA）的EVs。通过纳米粒子追踪分析（NTA），确认了EVs的粒子分布，大小峰值约为150 nm。通过Western Blot分析，证实了EV样本中存在CD9、CD63、CD81和Syntenin等EV标记物。

注：Syntenin 是一种蛋白质，在各种细胞过程中发挥作用，包括细胞内运输、细胞粘附和信号转导，与多个结合伴侣相互作用，参与蛋白复合物的形成和调控。syntenin 的主要功能之一是参与细胞外囊泡 (EVs) 的生物发生和分泌。Syntenin已被确定为 EV 标记物，通常用作确认样本中是否存在 EV 的标记物。syntenin影响细胞粘附、细胞扩散和细胞迁移。此外，syntenin与癌症进展和转移有关。研究显示，它通过调节参与癌症进展的细胞粘附、细胞骨架动力学和信号通路，促进肿瘤细胞侵袭和转移。

该方法检测结果直接读取荧光强度值如下：


但是作者发现，通过计算相对信号强度，即目标信号与所有信号强度之和的比值，可以更好地比较EV的特征，并描绘出特定于某些细胞系的标记物，如下图。


实施这种归一化策略可以直观可视化不同的EV标记真实强度。上图可见，在癌细胞衍生的EV谱中检测到某些标记物的相对增加，与正常原代星形胶质细胞衍生的EV相比：LN18-EVs中CD44和CD90升高；LN229-EVs中CD36、CD54、CSPG4和GD2升高；NCH82-EVs中CD13、CD49e、CD49f和CD90升高。CSPG4、CD36、CD44和GD2已被证明与癌细胞迁移和/或增殖有关。因此，携带这些标记物的EV确实可以作为胶质母细胞瘤的生物标志物。

参考文献：Brahmer A, Geiß C, Lygeraki A, et al. Assessment of technical and clinical utility of a bead-based flow cytometry platform for multiparametric phenotyping of CNS-derived extracellular vesicles. Cell Commun Signal. 2023;21(1):276. Published 2023 Oct 6. doi:10.1186/s12964-023-01308-9  IF: 8.4 Q1