有没有人用过国产的破膜固定液

chujindong

找公司买破膜、固定液，但是现在都没有现货，他们给提供了四正柏的产品信息。
固定液：4％多聚甲醛、NaOH、NaH 2 PO 4  、1％胎牛血清；pH 7.4-7.6
破膜剂：0.1%皂素、0.1%叠氮钠、1％胎牛血清、HEPES、PBS
看试剂成分似乎是可以用的。因为皂素确实是破膜剂的一个最重要的成分，但是因为没有听说有谁用这种国产货做过实验，心里没底。不知道大家有没有使用经验？
因为急着用，而且这个也不贵，我已经订了一份了，想试试看效果如何。

liangyoubao

应该没问题，我们用过，还好。

chujindong

BD的FIX/PERM挺奇怪，FIX就FIX吧，为什么要PERM?按说就应该先固定，固定完了再破膜。而且如果只是固定的话，我们完全没有必要买进口的，自己用多聚甲醛加PBS就行了，也不需要等货周期了。

niwanmao

chujindong 发表于 2011-12-28 11:26

                               
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BD的FIX/PERM挺奇怪，FIX就FIX吧，为什么要PERM?按说就应该先固定，固定完了再破膜。而且如果只是固定的话 ...

以前的文章倒都是用皂素破膜的，但是效果我想应该没有商业化的试剂好。你为什么不用FOXP3的固定、破膜剂来代替呢？就最后一步PERM成份稍微减少一点时间就可以了。

chujindong

niwanmao 发表于 2011-12-28 11:36

                               
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以前的文章倒都是用皂素破膜的，但是效果我想应该没有商业化的试剂好。你为什么不用FOXP3的固定、破膜剂 ...

我估摸着似乎用FOXP3的也可以，但是也不能确定啊，因为我测细胞因子，只需要破细胞膜就可以了。

chujindong

我看几年前国内有人发表中文文章，用的试剂还不是进口的，都是自己配得。

niwanmao

chujindong 发表于 2011-12-28 11:56

                               
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我看几年前国内有人发表中文文章，用的试剂还不是进口的，都是自己配得。 ...

如果要发文章，建议先按照文献上的配方自己配。
如果只是平时检测，建议可以尝试一下FOXP3破膜剂，应应急：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1211

niwanmao

chujindong 发表于 2011-12-28 11:56

                               
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我看几年前国内有人发表中文文章，用的试剂还不是进口的，都是自己配得。 ...

给你一个flow cytometry protocols一书第73页的protocol：
2.3. Surface + Intracellular Staining (Saponin Protocol)
1. Reagents:

• 1X PBS (phosphate-buffered saline): Dissolve 1.44 g of Na2HPO4, 0.24 g of KH2PO4, 8 g of NaCl, and 0.2 g of KCl in 850 mL of distilled water. Adjust the pH to 7.4 with HCl and volume to 1 L. Store at room temperature.
• Fetal calf serum (standard cell culture FCS). Store at 4°C.
• Formaldehyde: Paraformaldehyde stocks of 4–36% can be made or bought (we use 16% paraformaldehyde stocks, cat. no. 15710 from Electron Microscopy Sciences, Washington, PA). See Note 2 for preparation. Store at room temperature.
• Staining media: 1X PBS, 4% FCS, and 1 mM sodium azide. Store at 4°C. (See Note 3).
• EDTA: Make a 5 M stock solution and use in preparation of the PBS–EDTA buffer. EDTA is used to avoid cell clumps during flow cytometer acquisition. Store at room temperature.
• PBS–EDTA: PBS and 1 mM EDTA. Store at room temperature.
  

2. Saponin: Make a 10% saponin stock solution by mixing 10 g of saponin(containing ≥25% saponingen content, from Sigma, St. Louis, MO) with 100 mL of PBS. Place at 37°C until saponin has dissolved with mild stirring. Sterile filter (0.22 μL) and store at 4°C (see Note 4).
3. Phospho wash buffer: PBS, 1 mM β-glycerol phosphate, 1 mM sodium orthovanadate, 1 μg/mL of microcystin (500-μg vials can be purchased through Calbiochem, now EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA), and 1 mM azide. This is the base buffer for all subsequent buffer formulations. Store at 4°C.
4. Saponin permeabilization buffer: Phospho wash buffer, 0.2% saponin, 4% FCS, and 1 mM azide. Store at 4°C. Final saponin concentration for permeabilization should be no less than 0.1% per sample. A 0.2% solution is made to account for residual volume in wells left after wash (see Note 5). Store at 4°C.
5. Saponin staining buffer: Same as saponin permeabilization buffer.