关于PI做周期的一些心得

cccssszzz08

最近正在学习流式细胞仪的使用，现在上手的是细胞周期的测定。关于周期的测定有一些体会，写在这里给大家分享一下吧。
1.关于细胞的离心
其实离心只要1500-2000r/min就可以了。原来不懂相对离心力和转速的换算，走了很多弯路。多谢倪老师的指点才让我茅塞顿开。最一开始做周期的时候，总感觉细胞在70%乙醇中固定的时候离心不下来，离心后有很多漂浮的白色物质。可是加大转速的话，又会导致有很多细胞碎片。经过一番系统的学习，才知道只要转速达到了，该离心下来的细胞都会下来的，那些白色的物质可能是断裂的DNA吧，不用管它就好。经常做周期的时候离心完都看不到细胞，然后只能抹黑抓瞎继续做，到了最后一样能检测到细胞的。
2.关于PI染色
因为PI不能穿过正常的细胞膜，所以在染色的时候，为了增加细胞的通透性，会加入表面活性剂TritonX-100,我们实验室一般会把PI配成10*的。刚开始我怕PI染不上，就没有按照比例稀释，结果导致染液中的Triton过大，上机几乎看不到完整的细胞了。全是碎片，随即拿到光镜下也看到的都是碎片。经过一番排查（每一步操作都观察形态），排除掉了乙醇固定和离心的问题，最终认为就是染液中的Triton浓度太大造成的，稀释浓度后问题就解决了。
顺便说一下，我们的PI和RNase是单独配制的，染色时，共同孵育。
3.关于结果分析
我个人觉得在流式细胞仪结果的分析中，认为的主观因素占有很大的比例，尤其是在周期中。通过不同的圈门方式，可以认为的把CV,RCS值降低，并且改变周期中的比例，我不知道这样做算不算是学术造假。反正我分析的时候尽量是按照自己想要的方向分析的，不知道老板知道了会不会发怒啊！嘿嘿
这几天在论坛里逛了好久，发现这里高手如云。对我一个刚接触流式的小白有很大的帮助。上面写的一点都是我一个菜鸟的“心得”。希望大侠们不要笑话我白痴哈。关于流式细胞仪测周期的实验，还有许多问题想向大家请教，希望大家能够多多交流，相互帮助。
最后衷心的感谢一下倪老师的帮助！谢谢

niwanmao

这种经验型的帖子是我们最喜欢看到的，非常感谢@cccssszzz08 的分享，这个帖子相信可以让很多朋友少走很多弯路。

gagyyl

我也这么觉得，感觉流式圈门的时候主观因素影响很大，稍微懂一点点，P值就从无差异变成有差异了，尤其是对于界限不明显的流式图，不知道大家怎么看？

niwanmao

gagyyl 发表于 2018-5-2 18:19
我也这么觉得，感觉流式圈门的时候主观因素影响很大，稍微懂一点点，P值就从无差异变成有差异了，尤其是对 ...

主观性大，那是因为没有设置正确的对照。
设门位置的最佳选择是生物学阴性对照，即不表达该抗原的同种类细胞（SSC和FSC尽量比较接近）。其次在多色实验中，还可以采用FMO对照。
对照设置好了，你的设门才会客观。

gagyyl

晚辈受教了，谢谢老师