细胞内活性氧测定

赖浩强

请问各位老师，我用DCFH-DA做细胞内活性氧检测时，结果总是随时间推移下降。我看到有贴说有类似情况后来重新检测又上升了。我想问我检测的结果下降是什么原因？（据说我们所用的化合物是产生ROS的）已经做了7、8遍了，还没找出原因。不知道各位老师可否帮我解决？可否有protocol提供？

niwanmao

@cccssszzz08 站友做过，可以帮忙答疑一下。

站内的相关链接见：
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-255-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1477-1-1.html

niwanmao

会不会你这种化合物是产生ROS的，但是细胞本身存在一定的抗氧化机制，所以导致随着时间推移，效果逐渐不明显了？或者是protocol本身问题？逐个排除原因吧。

cccssszzz08

首先先说一下DCFH-DA的情况吧，作为一种ROS捕获剂，它能够通过细胞膜进入到细胞，在细胞内酯酶的作用下脱去二脂，生成不发光的DCFH，当细胞内存在过氧化氢，超氧离子，羟基等ROS时，则被氧化成DCF，咱们就是通过测定这个DCF的荧光强度来对细胞的ROS做出评价的。
用这个探针的时候，有的时候是先用药物刺激，有的时候是先装载探针。如果刺激时间较短（2h以内）的话，一般都是先装载探针的，待到刺激起来的时候就立即上机检测（梁智辉版《流式细胞术基本原理与使用技术》P116）。这就说明ROS的产生有可能是一个短暂或者是瞬时的过程，就像倪老师说的那样，随着时间的推移，产生的ROS有可能会被胞内的抗氧化物质所中和，导致后来的检测中ROS降低。
还有一种情况就是看你样本的保存条件，是不是没有避光呢？我曾经做过荧光显微镜的原位染色观察，发现DCF是可以猝灭的，也有可能是这个原因导致再次检测ROS降低。
具体是什么原因多做两次好好排除一下吧，反正我觉得一般染色后应该立马检测，要是想做药物作用时间延长对ROS的影响的话，需要多加一组实验的吧。
回答的不是很准确，希望能够帮助你，咱们一起探讨！

赖浩强

谢谢老师的解答，让我知道很多了。还有可能我说的不是很清楚，我是先用探针孵育半小时后再加到预先处理好的药物中，再立马用荧光酶标仪检测的。一开始检测的时候，加药组的荧光值就比对照组低。从开始到结束荧光值都没升都是比对照组低，而且随药物浓度上升荧光值越是下降。老师讲的那个随时间下降，是指先上升之后才下降的情况吧？

cccssszzz08

赖浩强 发表于 2013-3-14 14:53

                               
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谢谢老师的解答，让我知道很多了。还有可能我说的不是很清楚，我是先用探针孵育半小时后再加到预先处理好的 ...

我不是什么老师啦，只是一个小研究僧而已。有问题大家一起探讨交流么。。。
您说的那个，根本就没有高过对照组，有没有阳性对照来说明呢？要是阳性对照也没有升高的话，考虑一下倪老师说的protocol的问题，或者是染料的问题。（我用的是sigma的）