Annexin V and PI做细胞凋亡遇到的问题

cellprobe

请大家来帮我看看。我的原因出在什么地方。
第一张图是没有经过任何处理的细胞，在实验之前细胞的存活率几乎是100%。

没有药物处理的细胞

第二张图是用热击方法处理的细胞：56度一分钟，然后37度一个小时。据说这种方法能诱导凋亡，所以这组细胞是我认为已经是发生了凋亡并用作荧光补偿的。

热击处理的细胞

第三张图是Doxorubicn处理12时的细胞。

Doxorubicin处理的细胞

问题1：正常的没有经过处理的细胞却出现明显的FITC（Annexin V）染色。

问题2 ：在热处理的细胞中，大部分细胞是PI和FITC阴性的，是不是这种热诱导的方法没有引起细胞的大量凋亡？

最重要的问题：在FITC stained control 中，无论我怎么调节补偿都不行。一般的经验是从FL2中减去20-30%的FL1就行。可我无论怎么调节补偿都搞不定。

麻烦你帮我看看我的数据了。我周围无人可问啊！

多谢!

niwanmao

这个补偿确实没有调好。PI-AV补偿值不一定死板的局限于20、30以内，可以增加到40-60也都可以，因为它们的性质不同于常见的FITC和PE。
同时，AV-PE补偿可以稍微再小一点，图上看有点过补偿。

从结果看，正常细胞和热处理细胞结果类似，说明正常细胞也存在凋亡，可能跟你的细胞状态有关，而热处理并没有增加凋亡比例，说明热处理无效。还是用药物诱导凋亡更靠谱。

cellprobe

倪老师，你好。我重复了这次试验。第一张图片是没有经过任何药物处理的对照细胞。

第二个图片是经过乙醇处理的细胞：

我尝试了倪老师昨天的建议，把FL1的电压增大，补偿是FL1-60%FL2。我不知道这次结果怎样？还有用于调补偿的single control
是不是应该有一个阳性群体和一个阴性群体才算是好的？这次用乙醇处理细胞可能时间有点过长，以至于FITC single control阴性的群体很少。

谢谢

niwanmao

cellprobe 发表于 2013-7-4 18:57

                               
登录/注册后可看大图

倪老师，你好。我重复了这次试验。第一张图片是没有经过任何药物处理的对照细胞。

第二个图片是经过乙醇处 ...

嗯，这次补偿好很多。
乙醇处理过的细胞单染管似乎存在不少的非特异性染色。不过不要紧，我觉得你就做正常细胞即可，因为你的正常细胞就已经分群很明显了，无需另外做单染了。

cellprobe

倪老师，乙醇处理的细胞似乎非特异染色很多，可能是乙醇处理这种方法造成的，我还是用药物处理最好，我准备做一个药物处理时间梯度。但是下一句话我不明白什么意思:我觉得你就做正常细胞即可，因为你的正常细胞就已经分群很明显了，无需另外做单染了。还有FITC单染的有什么问题吗？我觉得还是不好。

niwanmao

cellprobe 发表于 2013-7-4 20:11

                               
登录/注册后可看大图

倪老师，乙醇处理的细胞似乎非特异染色很多，可能是乙醇处理这种方法造成的，我还是用药物处理最好，我准备 ...

用FITC单染没有问题，我只是觉得细胞分群很清楚，所以调节电压、补偿都可以直接在双染管上进行。

cellprobe

niwanmao 发表于 2013-7-4 20:24

                               
登录/注册后可看大图

用FITC单染没有问题，我只是觉得细胞分群很清楚，所以调节电压、补偿都可以直接在双染管上进行。 ...

这次做的不好的地方就是乙醇处理的细胞背景有点太高。这次把FITC的电压提高了的确能改善很多。FITC单染的是不是阴性细胞群太少？为什么PI单染的阴性细胞群比FITC单染的阴性细胞群多？谢谢！

niwanmao

cellprobe 发表于 2013-7-4 20:34

                               
登录/注册后可看大图

这次做的不好的地方就是乙醇处理的细胞背景有点太高。这次把FITC的电压提高了的确能改善很多。FITC单染的 ...

两者细胞看上去多少这是视觉上的误差，你可以看百分比就知道了。

sally_no10

1.分群好就不需要做单染。个人觉得单染就是调补偿用。补偿可以的话是可以不做。
2.为啥要用乙醇处理？不需要的话就去掉吧。直接上药物就可以。不是多么复杂的多标。
3.背景高我也遇到过。有时候是盒子的问题。你可以在细胞数不够的情况下按比例降低体系，尤其是A的。
4.正常细胞有凋亡是正常的。跟细胞的状态，处理的操作，消化的胰酶都有关系。个人觉得，用不含EDTA的胰酶很重要。还有就是如果是在孔板里做的干预，可以适当降低消化时间。洗细胞也不需要太多次。
5.我觉得你的趋势挺好啊。可以尝试收一下培养基里漂浮和贴壁不紧的细胞再消化，总和到一起上机。有些药物会造成早中期凋亡的细胞粘附能力下降。舍弃这部分细胞往往出不来趋势。
6.我觉得技术上问题不大，细节的把握还是实验的关键。
个人观点，欢迎指正。

sally_no10

另外补充一下。我觉得你的补偿比较好调。有时候不好调，跟机器的质控也有关系。因为用的十字门，有时候我为了好分析，宁愿压点轴也得调好。
凋亡的结果是个动态的趋势。所以要动态着看。实际上你的实验组里，阴性群已经发生了右下的侧移。这也就是趋势。你把gating做好再看结果。流式的图是不能用眼判断的。贴阴性群做cross gate.前向侧向先去掉碎片。