请问ROS结果如何分析

sherry123

    检测ROS时，同一种类细胞分不同批次用流式检测ROS时，不知为什么，有时是单峰，有时是双峰，但会发生右移；所以，关于ROS结果的分析，希望请教以下几个问题：
    1、ROS流式检测的图形，是以出现单峰好，还是双峰好？
    2、如果是以单峰分析，是用平均荧光强度还是中位数进行评价？为什么？
    3、如果以双峰进行分析，流式细胞仪收集细胞时是以不加DCFH-DA的细胞去调节电压以界定阴性细胞群，但是加了处理因素和DCFH-DA的细胞会发生右移，偏移程度不同，且都是两个峰，所以不知道，应该以总体的平均荧光强度进行评价；还是需要划个二分门，分别计算阳性区域和阴性区域的平均荧光强度，但是右移程度不同且双峰明显的图二分门不知怎么划？
    希望有老师能给予解答，谢谢您！

dragonhzqsmmu

用DCFH去做，是否需要用一个已知或者公认的ROS诱导剂做阳性对照，比如说双氧水，然后把处理的细胞和阳性对照去比？

niwanmao

我的个人看法是。首先确认fsc-ssc圈的是同一类细胞，其次，如果出现双峰，应该把marker设置在两个峰中间

@dragonhzqsmmu  说的阳性对照也是一个办法。

sherry123

    您好！在fsc-ssc图中，细胞团很集中，不会圈错。不知道如果是双峰，能否不划门，直接用总体的平均荧光强度进行分析？

niwanmao

sherry123 发表于 2013-07-15 11:16:47

                               
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    您好！在fsc-ssc图中，细胞团很集中，不会圈错。不知道如果是双峰，能否不划门，直接用总体的平均荧光

最好设门看表达率，原则上如果能够用百分比比较，最好用百分比。

didi_zhou

我做过的一般都是双峰或连续分布，如果发现是峰移很可能是处理时间过长或强度过大，需要重新做时效与量效。建议用SS/ROS双参划门，用未处理细胞做阴性确定闷得位置。ROS阳性的荧光强度会比较高，可能会用到ND滤片。

sherry123

对，我也发现如果从处理好样本到上流式细胞仪检测时间超过半小时，就基本是单峰了；但不确定是不是就这个因素引起。您说的用“SS/ROS双参划门”，没理解是什么意思，能具体解释一下吗？还有，ND滤片是流式细胞仪的吗？怎么用荧光显微镜可用ND滤片？

didi_zhou

sherry123 发表于 2013-7-16 09:29

                               
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对，我也发现如果从处理好样本到上流式细胞仪检测时间超过半小时，就基本是单峰了；但不确定是不是就这个因 ...

ND就是减光滤片嘛，所有光学设备都可以用。有时候ROS会出现太强的情况（贴在右边），这个时候就需要用到ND滤片，或者把激光功率调小。不过很多分析型的机器不支持这么操作。不过介于你能看见阴阳性群两个峰，应该也就不需要了。

SS/ROS双参数门如下图（实验不是ROS，不过原理一样）。由于细胞形态、大小以及状态的问题，细胞的分布在单参图上的分布貌似是正态的，但在双参图上不是。对于阴阳性很明显的分群，影响不大，但是对于一些连续分布的细胞群可能单用单参图划门就会损失一些比例（如图例中第三行的紫色群）。这些一般都是由于细胞折光不均匀引起的（非正圆形），所以加入一个SS对比例的确定更加好。

dragonhzqsmmu

didi_zhou 发表于 2013-7-16 10:01

                               
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ND就是减光滤片嘛，所有光学设备都可以用。有时候ROS会出现太强的情况（贴在右边），这个时候就需要用到N ...

学习了，老师讲解的很详细，多谢啦

sherry123

哦，您的图中SS INT就是指一般的SSC，就是做个FL1-SSC的图是吗？