流式细胞仪检测细胞内ROS表达水平

niwanmao

标题：流式细胞仪检测细胞内ROS表达水平

1、取对数生长期的细胞，均以4×10E5/ml的密度接种于6孔培养板上；
2、培养过夜后，用相应药物处理细胞；
3、消化收集细胞（悬浮细胞不需要消化），要注意掌握消化时间，避免细胞碎片产生过多；
4、PBS缓冲液清洗一次，随后重悬细胞于1ml的PBS缓冲液中；
5、加荧光探针CM-H2DCFDA至终浓度10 uM ，37℃孵育30分钟，上流式细胞仪分析活细胞内ROS的积聚情况。

矿泉水7

正好要做ROS检测，好好学习下！谢谢倪老师的分享！

苏格兰白草莓

请问ROS检测后如何分析 数据是使用荧光强度的平均值 还是峰的中值 还是峰面积下的几何均值？除此之外 是否还要除以该峰的细胞量 以使数据均一化呢？

苏格兰白草莓

做ROS时请注意酚红要去除 有些培养基里面含有酚红 在配液 或用无血清培养基洗涤的时候 注意应不含酚红 否则会影响检测

niwanmao

苏格兰白草莓 发表于 2014-10-20 14:04
做ROS时请注意酚红要去除 有些培养基里面含有酚红 在配液 或用无血清培养基洗涤的时候 注意应不含酚红 否则 ...

培养基要洗涤干净的吧。分析可以使用median，也可以用百分比。

苏格兰白草莓

niwanmao 发表于 2014-10-20 19:45
培养基要洗涤干净的吧。分析可以使用median，也可以用百分比。

我看到有些ROS说明书上面写的是染色前用培养基来稀释到工作浓度  实验中也发现酚红对ROS探针有抑制作用
当我们的峰是偏态分布的时候 那个中值和几何均值差别还是有点大 我感觉几何均值更能反应ROS的真实情况些呢 还有个就是有时候峰比较宽 用百分比感觉不是很适合 检测ROS的时候是否有要求关于峰的CV值呢？没有必要除以细胞量来进行均一化了是不是啊？

niwanmao

苏格兰白草莓 发表于 2014-10-21 10:38
我看到有些ROS说明书上面写的是染色前用培养基来稀释到工作浓度  实验中也发现酚红对ROS探针有抑制作用
...

最好先洗涤吧。
至于结果的表示，我建议首选还是百分比。MFI是实在迫不得已才用的，关于MFI的使用，参考：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3848-1-1.html，并且需注意：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2427-1-1.html

lantianbaiyun

倪老师，我最近在用流式测ROS，我遇到了很多问题，请倪老师帮我解答，我的实验组要用PTX处理4、6、8小时，这种情况也是先加药处理用PBS洗涤后，重悬后再加DCFH-DA？还是在时间点到之前前半个小时加DCFH-DA？谢谢倪老师了

niwanmao

lantianbaiyun 发表于 2016-1-13 23:16
倪老师，我最近在用流式测ROS，我遇到了很多问题，请倪老师帮我解答，我的实验组要用PTX处理4、6、8小时， ...

到时间点后，把药物洗涤2－3次去干净，再用DCFH-DA孵育。

lantianbaiyun

lantianbaiyun 发表于 2016-1-13 23:16
倪老师，我最近在用流式测ROS，我遇到了很多问题，请倪老师帮我解答，我的实验组要用PTX处理4、6、8小时， ...

到时间点后，把药物洗涤2－3次去干净，再用DCFH-DA孵育。

谢谢倪老师，我之前做过一次，在散点图中调电压找主群的时候，每次都是100％，这个结果正常吗？或者是电压调的太大了？谢谢倪老师