CFSE有两个峰

yuemin5

学习做人外周血淋巴细胞增殖检测。
Protocol如下：

1.        Ficoll离心提取患者PBMC，PBS（BSA 0.1%）于15mL离心管内调整细胞浓度至1X106/mL。

2.        按终浓度1uM,2uM,5uM加入CFDA-SE染液。

3.        加入预冷的含20% FBS培养基2mL，冰箱冷藏5min，洗涤第一次。

4.        加入预温含5% FBS培养基10mL，洗涤第二次。

5.        加入预温含5% FBS培养基10mL，37℃孵育5min，洗涤第三次。

6.        将细胞分于六孔板中。

7.        对照组用培养基加血清维持；实验室加入OKT3及IL-2等细胞因子刺激。

8.        染色后取1X106细胞检测其CFSE表达，确定检测电压值。

流式检测发现：
1、5uM CFDA-SE浓度下，得到的峰型最细长。是否能认为此浓度是最佳浓度，是否需要再加大？
2、每个浓度都有2个峰。是否为PBMC分离时红细胞的混入？如何处理？

1uM CFDA-SE

1uM

2uM  CFDA-SE

2uM

5uM  CFDA-SE

5uM

niwanmao

晕，这个问题似乎隔了好多天了。
培养了多久？会不会是淋巴细胞分裂了呢？FSC－SSC点图设门了么？

wolfrog

阳性高度有点低，还是电压设得低？
两个峰距离有点远，不像增殖
我猜有可能是两群细胞，你可以看看FSC-SSC里不同群的

didi_zhou

这个要看看前侧向，最好给原始结果来看看。

yuemin5

好久没来了，不好意思。都没有及时回复各位老师。
样本是刚分离的PBMC，我觉得是残留的红细胞。下次用氯化铵溶血试试。

niwanmao

yuemin5 发表于 2013-8-24 09:16

                               
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好久没来了，不好意思。都没有及时回复各位老师。
样本是刚分离的PBMC，我觉得是残留的红细胞。下次用氯化 ...

pbmc应该很干净了吧？怎么还会有红细胞呢？fsc/ssc散点图能传一个么？

yuemin5

我们分离PBMC的时候经常会有红细胞残留，这种情况在患者红细胞压积异常的时候特别明显，目前没有找到原因

niwanmao

yuemin5 发表于 2013-8-28 13:33

                               
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我们分离PBMC的时候经常会有红细胞残留，这种情况在患者红细胞压积异常的时候特别明显，目前没有找到原因
...

从这个FSC/SSC散点图看，似乎红细胞碎片应该不太有啊。
有没有试过反设门看看CFSE这两个峰对应的细胞在FSC/SSC散点图上分布在哪个位置？

yuemin5

如图：A门红色，B门绿色

yuemin5

两群细胞重叠，左下绿色那群下面是红色的