为什么我的样品不固定就染不上？

resurgam · 发表于 2013-7-27 22:33:35

新手。希望检测膜表面蛋白的变化情况。收细胞后将细胞分为2管，一管立即加抗体（BD公司的）4℃染1个小时，抗体的用量按照说明书的建议，10e6的细胞用1ul，染色时的体积为60ul。但是怎么也染不上，阳性率为1%左右；另一管用2%PFA在4℃固定过夜，使用同样的抗体量，染色时间和温度，阳性率为35%左右。检测的4个蛋白均是这种情况。由于想检测的蛋白在细胞膜表面表达量较少，不确定染出来的是不是假阳性？不知道为什么我的活细胞就染不上色了呢？

niwanmao · 发表于 2013-7-27 22:33:36

刘星宇发表于 2013-7-30 19:50

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孵抗体后固定，抗原表达下降（荧光淬灭）可以理解，但不明白为啥会增多呢？ ...

不是的，固定后不是荧光淬灭，而是由于自发荧光导致荧光强度增高。

你可以参考Changes in Fluorescence Intensity of Selected Leukocyte Surface Markers Following Fixation这篇文章：

淋巴、粒、单三群细胞固定前后荧光强度改变

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niwanmao · 发表于 2013-7-28 09:03:52

经过PFA固定后，细胞形态会发生明显改变，同时抗原表达峰多数情况下会右移，所以你所说的阳性率增高可能是假性增高。

建议：
1、BD的抗体多数是5－20ul用量，不知道是什么抗体，怎么只用1ul全量？
2、是否做了同型对照？
3、可以尝试改用室温下孵育15－20分钟。

resurgam · 发表于 2013-7-29 20:31:13

本帖最后由 resurgam 于 2013-7-29 20:34 编辑

niwanmao 发表于 2013-7-28 09:03

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经过PFA固定后，细胞形态会发生明显改变，同时抗原表达峰多数情况下会右移，所以你所说的阳性率增高可能是 ...

谢谢。用的是10ul，求助的时候少写了零。没有做同型对照，老板嫌贵，不让买。又做了一次，室温孵育30min，还是基本染不上，小于2%。抗体是7月份刚刚买的，应该不会失效的，孵育的时候及加抗体的时候已经注意避光了，但是不知道为什么就是染不上。
也曾考虑过该蛋白是不是表达量太低，所以检测不到，但是其中一个蛋白研究的人比较多，看到别人的染的挺好的。怎么我的就染不上了呢？
谢谢帮助！

niwanmao · 发表于 2013-7-29 21:28:31

resurgam 发表于 2013-7-29 20:31

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谢谢。用的是10ul，求助的时候少写了零。没有做同型对照，老板嫌贵，不让买。又做了一次，室温孵育30min， ...

对于表达量低的表面标记，必须做同型对照，否则无从判断其阳性表达率。这该花的钱还是得花的，况且同型对照其实相比抗体来说应该便宜很多才对，几百块的事情吧。

刘星宇 · 发表于 2013-7-30 16:14:01

niwanmao 发表于 2013-7-28 09:03

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经过PFA固定后，细胞形态会发生明显改变，同时抗原表达峰多数情况下会右移，所以你所说的阳性率增高可能是 ...

固定后细胞形态会发生改变？不太理解。

我有一次周五做，来不及上机，就用4%多聚甲醛固定，周一才孵抗体，发现抗原表达的确挺高的。

niwanmao · 发表于 2013-7-30 17:29:03

刘星宇发表于 2013-7-30 16:14

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固定后细胞形态会发生改变？不太理解。

我有一次周五做，来不及上机，就用4%多聚甲醛固定，周一才孵抗体 ...

跟胞内抗原检测时的固定一样，对细胞的FSC、SSC、表面抗原表达强度都有所影响。

刘星宇 · 发表于 2013-7-30 19:50:33

niwanmao 发表于 2013-7-30 17:29

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跟胞内抗原检测时的固定一样，对细胞的FSC、SSC、表面抗原表达强度都有所影响。 ...

孵抗体后固定，抗原表达下降（荧光淬灭）可以理解，但不明白为啥会增多呢？

刘星宇 · 发表于 2013-7-30 23:16:34

niwanmao 发表于 2013-7-30 21:45

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不是的，固定后不是荧光淬灭，而是由于自发荧光导致荧光强度增高。

你可以参考Changes in Fluorescence I ...

谢谢倪老师。

resurgam · 发表于 2013-7-31 02:56:18

niwanmao 发表于 2013-7-29 21:28

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对于表达量低的表面标记，必须做同型对照，否则无从判断其阳性表达率。这该花的钱还是得花的，况且同型对 ...

那我就悲剧了，老板是明确表明不让买同型对照的，ta觉得没有必要。老板让我这4个做出来了，就再试试其他7个，那样就要买11个同型对照了，老板是坚决不会同意的。
另，求教：PFA固定后的自发荧光对检测膜表面蛋白表达量的变化会有很大影响吗？觉得我自己做出来的结果还是有些影响的，上调或者下调的差别还有有不同的，但我老板说是平行试验，所以影响不大。
谢谢！

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