凋亡检测问题

samly0

请教各位老师，最近做悬浮细胞的凋亡检测，测了20、40、60ug3个药物浓度分别在24h、36h、48h的作用，用Annexin V-PE/7-AAD标记，出现以下问题：1、Annexin V的补偿还要不要再往下调点，总觉得再调Q3象限就会有细胞压边了；2、重复了3次实验，同一时间都有浓度梯度变化，但同一浓度不同时间，问题就来了，36h怎么比24h凋亡率还轻呢？3、用Diva软件做的，操作还不太熟练，所以有些图坐标轴是10^1,有些是0，我也想知道用哪个合适？是不是统一就行？用flowjo分析的，抽空再统一整理了。

niwanmao

1、ANNEXIN V的补偿可以再调一点点，也可以不调，问题不大。按照现在的补偿，可以设一个稍微不一样的十字门（如下图），这种门是可以的。如果要调下去，可能部分细胞会到坐标轴下面，但是可以利用logicle转换把负值显示出来。


2、从图上看，36小时的细胞开始转向晚期凋亡或死亡了。所以早期凋亡的比例会降低。
3、坐标轴不是问题。都可以。

samly0

倪老师，请问怎么用logicle转换把负值显示出来？还有，单就40ug浓度组而言，24h、36h、48h的凋亡变化似乎凌乱的，24h凋亡最厉害，怎么介于中点的36h时间点反而是最轻的呢？我曾经认为会不会是24h作用时，对药物敏感的细胞都凋亡了，剩下耐药的又继续增殖，所以36h又变轻了，但是又解释不了48h后的变化，用的细胞是淋巴瘤细胞株。重复了3次，时间变化都是一样的趋势，要是有实时细胞监测仪就好了，打报告申请了三年，院方都不批，汗！

samly0

可不可以认为这种淋巴瘤的细胞增殖周期是24小时，而对药物最敏感的时间段在24h、48h？那我把12h也做上看看会不会跟36h的结果一致。后面再做周期，结合周期结果分析

niwanmao

samly0 发表于 2013-8-9 10:48

                               
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倪老师，请问怎么用logicle转换把负值显示出来？还有，单就40ug浓度组而言，24h、36h、48h的凋亡变化似乎凌 ...

你是用flowjo分析，点击坐标轴边上的一个“T”字母，就可选择。

至于凋亡。我觉得这24和48小时的双阳性区域的坏死细胞都很多，就36小时的坏死细胞反而少，这不合常理啊。即使从总比例来看，也是36小时最少。想不通。

samly0

是呀，做了三次都是一样的结果，我下周加个12小时组看看结果怎样，到时再讨论

niwanmao

samly0 发表于 2013-8-9 15:34

                               
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是呀，做了三次都是一样的结果，我下周加个12小时组看看结果怎样，到时再讨论 ...

这个药物的毒性感觉还是挺大的，PI阳性的这么高。

samly0

这个药物抗肿瘤效果很明显的，细胞是淋巴瘤细胞，我打算分离点正常人淋巴细胞试试这个药对正常细胞的毒性，比较看看

samly0

niwanmao 发表于 2013-8-9 19:09

                               
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这个药物的毒性感觉还是挺大的，PI阳性的这么高。

我用的是7-AAD

niwanmao

samly0 发表于 2013-8-11 11:35

                               
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我用的是7-AAD

看错了，不好意思。

我在想，如果你FSC/SSC设门了，那么36小时AV+7-AAD－和AV+7-AAD+的比例都降低了，是不是跟FSC/SSC设门有关？