外周血单个核细胞培养

gaarakang

分离外周血单个核细胞培养5天死去很多细胞影响流式分析，有相同经历的人进来交流下吧！（用的是RPMI1640培养基加10%的FBS）

niwanmao

细胞状态的影响因素很多：
首先最常见的就是要排除污染，例如细菌污染、支原体污染等，可通过观察培养基本底和细胞内部颗粒推断；
其次要排除细胞因培养基或血清问题导致非正常死亡，可在收集细胞后，加入0.4％台盼蓝染色15分钟查看其活力；
最后要排除一下流式上机前那些处理步骤的因素影响，有时候可能某个或某几个试剂没配对，导致细胞在处理过程中发生非正常死亡。

gaarakang

niwanmao 发表于 2013-8-9 20:51

                               
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细胞状态的影响因素很多：
首先最常见的就是要排除污染，例如细菌污染、支原体污染等，可通过观察培养基本 ...

恩，谢谢老师细菌污染基本可以排除，溶液并每月浑浊，但不知怎么排除支原体污染？很多文献用IL-2，但不知IL-2是否会诱导Treg的生成？

dragonhzqsmmu

外周血单个核细胞培养是什么种属的？人的还是大小鼠的？
培养是为了后续的细胞分离还是因为要做流式细胞的刺激，后者的话一般需要加因子刺激的，如果没有因子刺激的话会大量凋亡的，这个时候可以加用细胞死活的染料，诸如PI等等共染，在FC分析时排除掉这部分细胞的影响

gaarakang

dragonhzqsmmu 发表于 2013-8-11 09:21

                               
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外周血单个核细胞培养是什么种属的？人的还是大小鼠的？
培养是为了后续的细胞分离还是因为要做流式细胞的 ...

这个是人外周血PBMC，培养第5天最后5小时用PMA,IO刺激，并用BFA阻断细胞因子的分泌，目的用来做流式检测细胞因子。

niwanmao

gaarakang 发表于 2013-8-11 10:14

                               
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这个是人外周血PBMC，培养第5天最后5小时用PMA,IO刺激，并用BFA阻断细胞因子的分泌，目的用来做流式检测 ...

为什么要培养5天后再刺激？而不是提取后马上刺激或全血直接刺激？

gaarakang

也有直接刺激5小时的，刺激5天是看IL-35，因为培养5天后才有IL-35

gaarakang

niwanmao 发表于 2013-8-11 19:37

                               
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为什么要培养5天后再刺激？而不是提取后马上刺激或全血直接刺激？

也有直接刺激5小时的，刺激5天是看IL-35，因为培养5天后才有IL-35

niwanmao

gaarakang 发表于 2013-8-11 19:45

                               
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也有直接刺激5小时的，刺激5天是看IL-35，因为培养5天后才有IL-35

咦？你前面不是说分离出之后培养5天，最后5小时才用PMA和IO吗？这里怎么又说刺激5天？

gaarakang

niwanmao 发表于 2013-8-11 19:59

                               
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咦？你前面不是说分离出之后培养5天，最后5小时才用PMA和IO吗？这里怎么又说刺激5天？ ...

哦，没有说清楚，取血之后混匀，取出500微升刺激5小时，剩下的分离PBMC并培养5天，在最后5小时时刺激，