大鼠EPCs的检测

PercyLaw

倪老师好！我是流式的新手，想检测大鼠的内皮祖细胞（EPCs），想和您以及论坛里的高手请教一下：
1、我想检测的是大鼠的外周血和骨髓。在EPCs的培养过程中，我的骨髓是用的Ficoll分离法，但是我有看到有人讲Ficoll法会丢失细胞，使得本来就少的EPCs变得更加难检测，那我是不是骨髓的冲洗液也应该用红细胞裂解液进行处理呢？
2、大鼠的外周血大概需要取多少才够呢？是不是也要用红细胞裂解液，而尽量少用Ficoll法？
3、我打算用CD34+和KDR（CD309）+两个来标，我提取出来的单核细胞是不是可以先固定然后标抗体呢？（学校的流式老师放假了，我想要拿到别的地方测，但是可能要过夜甚至隔日，不知道该怎么操作）
4、CD34+和KDR（CD309）+两个来标的大鼠EPCs该怎么设门呢？

谢谢大家！

dragonhzqsmmu

也是准备做这个的，回答可能不是很准确，建议多听取大家的建议

1、这个分析我个人建议还是用全血，ficoll肯定会损失的，如果只是分析数量而不是为了培养，少用ficoll，ficoll主要的目的是减少杂质细胞的数量，裂红是必要的，必要时可以两次或者加大裂红液的用量以减少RBC的干扰
2、大鼠我没有做过，是用的小鼠的全血做的，一般是用100ul-200ul的量，也有用500ul-1ml全血的（老外比较严谨，一般用量偏大，从统计的角度来说，取样标本越大越逼近总体）根据你选用的marker的复杂程度，因为在两标的基础上加一标会导致收集的目的细胞的数量指数性降低
3、如果要过夜做检测，可以先抗体标记好再2%的多聚甲醛固定4度保存
4、两个marker个人感觉不是很准，是否考虑过三标或者四标？

PercyLaw

dragonhzqsmmu 发表于 2013-8-11 09:16

                               
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也是准备做这个的，回答可能不是很准确，建议多听取大家的建议

1、这个分析我个人建议还是用全血，ficoll ...

我曾经考虑过再标CD133，然后找了很久，发现只有美天旎卖人的，后来仔细查这个marker，发现在小鼠里，这个marker变成了prominin-1，在大鼠里的这个marker的抗体我还没有找到。另外，我以前做过人的外周血EPC检测，2ml人的外周血做出来EPC的含量特别低。然后实验室的技术员老师建议使用多一点的外周血含量，比如10ml再试试。由于这么大的血量是不好取的，所以我流式这一关一直没有什么大的突破。

PercyLaw

dragonhzqsmmu 发表于 2013-8-11 09:16

                               
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也是准备做这个的，回答可能不是很准确，建议多听取大家的建议

1、这个分析我个人建议还是用全血，ficoll ...

大鼠的抗体还是很难找的。

niwanmao

PercyLaw 发表于 2013-8-11 19:01

                               
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大鼠的抗体还是很难找的。

大鼠的抗体确实非常稀少，我刚才也帮你找了一圈，真找不到。实在找不到就只能用这两个了。你看的其它参考文献是不是就用这两个？

上述问题@dragonhzqsmmu 的回答都很好，至于多聚甲醛固定，我们一般用1％，略有不同，问题不是很大。大鼠的外周血你能取多少尽量多取点，这样最后离心浓缩成一管100ul的，用CD34和KDR标记。

相关参考链接：
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2229-1-1.html
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-731-1-1.html

dragonhzqsmmu

PercyLaw 发表于 2013-8-11 19:01

                               
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我曾经考虑过再标CD133，然后找了很久，发现只有美天旎卖人的，后来仔细查这个marker，发现在小鼠里，这 ...

2ml的人外周血?
LZ是怎么处理的？这个全血体积耗费流式抗体是不小的一笔开支了

dragonhzqsmmu

niwanmao 发表于 2013-8-11 21:09

                               
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大鼠的抗体确实非常稀少，我刚才也帮你找了一圈，真找不到。实在找不到就只能用这两个了。你看的其它参考 ...

倪老师的建议“离心浓缩”，您是指不论原始的全血体积是多少，裂红后离心用流式buffer重悬到100ul再标记流式抗体？

PercyLaw

dragonhzqsmmu 发表于 2013-8-11 23:09

                               
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2ml的人外周血?
LZ是怎么处理的？这个全血体积耗费流式抗体是不小的一笔开支了 ...

我也是裂红然后离心后标的。但是，由于EPCs的含量很少，所以抗体我觉得没必要增加用量，不知道您觉得这样考虑是否妥当？

PercyLaw

niwanmao 发表于 2013-8-11 21:09

                               
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大鼠的抗体确实非常稀少，我刚才也帮你找了一圈，真找不到。实在找不到就只能用这两个了。你看的其它参考 ...

倪老师，说实话，我真没有看到过关于大鼠的EPC检测流式文献，不知道您有没有看过的推荐的呢？
另外，抗体标记后，多聚甲醛固定后大概可以避光存放几天呢？是离心后固定还是悬成悬液呢？是不是直接拿着多聚甲醛细胞悬液去测试就可以上机呢？
您能不能就设门这个提点指点呢？

我是流式小白，谢谢倪老师啦！

niwanmao

dragonhzqsmmu 发表于 2013-8-11 23:11

                               
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倪老师的建议“离心浓缩”，您是指不论原始的全血体积是多少，裂红后离心用流式buffer重悬到100ul再标记 ...

大鼠能取到多少血啊，估计肯定能浓缩到100ul吧。
我们在临床上是首先进行细胞计数，如果密度小于1×10E7/ml的，那么就浓缩至该密度，如果大于该密度的，则进行稀释，最后取100ul，就刚好是1×10E6细胞。