关于FMO设门问题

木石织梦

各位大侠好！
       偶最近做CD4+CD62L+ T细胞的流式，发现自己做的CD62L-PE这个荧光总是分不开，看了说明书，似乎它确实是分不开？所以就试了最近在贵宝地刚学的FMO设门。简单介绍下附件的几个管，按顺序就是空白管，CD4-FITC单染管，CD4-PE单染管和实验管。
       大侠们帮我看看，我理解的FMO设门（根据FITC单染设PE的位置大概在10^2后两格，根据PE单染设FITC位置大概也在10^2后两格）是不是这么设的，还是我理解错了？总感觉实验管的门的位置怪怪的。还是其他哪里出了问题？请各位大侠不吝赐教！

haven_t

CD4-FITC单染管，CD4-PE？这样做好像不叫FMO吧，觉得应该用CD62L-PE单染管

木石织梦

haven_t 发表于 2013-8-16 12:25

                               
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CD4-FITC单染管，CD4-PE？这样做好像不叫FMO吧，觉得应该用CD62L-PE单染管

这样吗？不过，就算用CD62-PE做单染，划的是FITC的门，我觉得主要还是PE这个通道上，门的位置不知道在哪里。难道我非要做个同型对照吗？

sunyanxia

我感觉那个门要往上画，从散点图看还是有分群的迹象，可以尝试换成直方图观察是否有不同的峰。在调节方案时，最好是用所用抗体的不同单染进行，如CD4-FITC CD62L-PE的单标进行补偿调节。同型对照调节电压

niwanmao

木石织梦 发表于 2013-8-16 15:01

                               
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这样吗？不过，就算用CD62-PE做单染，划的是FITC的门，我觉得主要还是PE这个通道上，门的位置不知道在哪 ...

试试这样设门看：


看来CD62L存在相当高的非特异性结合。
解决方案：1、抗体滴定； 2、Fc阻断。   抗体滴定可以先考虑。

木石织梦

niwanmao 发表于 2013-8-16 15:37

                               
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试试这样设门看：

那还是不能像我这样“所谓的“FMO设门？

niwanmao

木石织梦 发表于 2013-8-16 16:08

                               
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那还是不能像我这样“所谓的“FMO设门？

对于双色实验，可能FMO的意义不大。更多的是减少非特异性结合。
还是进行一下抗体滴定吧，滴定步骤见http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-290-1-1.html

木石织梦

niwanmao 发表于 2013-8-16 16:10

                               
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对于双色实验，可能FMO的意义不大。更多的是减少非特异性结合。
还是进行一下抗体滴定吧，滴定步骤见http ...

哦，这样，可是都是按说明书用的，还需要滴定，这是不是说明公司的还没做到位哇？

木石织梦

木石织梦 发表于 2013-8-16 16:13

                               
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哦，这样，可是都是按说明书用的，还需要滴定，这是不是说明公司的还没做到位哇？ ...

请老师再帮我看看，附件里的是说明书里的图，这样的图是不是说明本来这个抗体，它就是这样没法明显分群的？

niwanmao

木石织梦 发表于 2013-8-16 16:13

                               
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哦，这样，可是都是按说明书用的，还需要滴定，这是不是说明公司的还没做到位哇？ ...

说明书推荐的量只是说明在他们做的条件下，那个量是比较标准的，但在实际中，每个人用的细胞种类不同，条件也会存在差异。
按照标准操作，每种抗体在做之前都需要进行抗体滴定，这是必需的，只是国内还有我们临床上为了节省成本，所以都不做。但我们的免疫分型由于只需要判断其表达强度即可，所以问题不大。但是象你们需要精确的定百分比，就需要做了。

抗体滴定并非说公司的没做到位，而是由于抗体批次不同、保存时间不同，本身就需要滴定。