Annexin V/PI测凋亡，对照组凋亡率很高

yelinghao215

用Annexin V/PI双染测紫杉醇制剂对乳腺癌细胞MCF-7的凋亡情况，采用的是同仁的试剂盒，方法如下：
1.药物孵育24h后，收集培养基，用4度的PBS清洗细胞一遍，清洗的PBS也收集在管里。
2.加入400μL/孔的0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化约6min，轻轻摇晃6孔板肉眼可见细胞脱落，然后加入之前收集的培养基终止消化，用1mL的移液器轻轻吹打孔内细胞并收集于管里。
3.300g离心力下（1300rpm）室温离心5min后弃上清，加入4度PBS轻轻重悬细胞，再次离心（离心条件与上次一致）。
4.离心完成后弃上清，加入500μL binding buffer重悬细胞。
5.取出100μL于1.5mL离心管里，加入5μL的Annexin V-FITC和5μL的PI工作液后，加入400μL binding buffer轻轻混匀。
6.室温15min后上机检测。
测定出来的流式图用FCS express调完补偿后，发现阴性对照组的凋亡率和给药组的凋亡率很接近，在20%左右，不知道是什么原因，请大侠出来帮忙！！！

niwanmao

贴壁细胞最主要的就是消化过程中导致的膜的破坏，这个很难避免。我想，你有没有可能在消化时间上再稍微缩短一点（如1－2分钟），配合摇晃使贴壁细胞下来，减少胰酶作用时间？

看到BD有个Accutase，似乎消化效果也差不多，NIH 3T3细胞的AV+PI+细胞比例也很高：http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_Protocol_AnnexinV_Staining.pdf

yelinghao215

niwanmao 发表于 2013-8-19 21:25

                               
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贴壁细胞最主要的就是消化过程中导致的膜的破坏，这个很难避免。我想，你有没有可能在消化时间上再稍微缩短 ...

老师，谢谢您的指导，我刚刚看了BD的protocol，里面消化细胞选用的不是胰蛋白酶，而是Accutase，我上网搜索了一下，这是一种更温和的细胞消化试剂，我准备试试这个。