外周全血细胞的Treg分析

yanyanwaiwai

做外周全血细胞的Treg分析，用的是Beckman的FITC-CD4，PC5-CD25，溶血素，和Ebioscience的PE-FOXP3，破膜系列。步骤如下：
1、加CD4，CD25避光染色20分钟
2、溶血10分钟
3、用2毫升冰盐水洗涤
4、加1毫升现配的破膜液，避光，室温40分钟，期间漩涡震荡一次
5、加2毫升BUFFER洗涤一次
6、再次洗涤一次
7、加FOXP3避光染色30分钟
8、加2毫升BUFFER洗涤一次、
9、盐水重悬上机检测
发现CD25 (HIGH)FOXP3+的细胞非常少，几乎没有，查看FOXP3的图，觉得是抗体和抗原都没有结合在一起。不知道是破膜的问题，还是抗体的问题
曾经按要求在4度破膜也是如此，延长破膜时间，图形也没什么变化。网上说Ebioscience的FOXP3很不错啊，怎么我就是做不出来呢？我考虑过是不是Beckman试剂的影响，可是换了Ebioscience的CD4，CD25也还是不行。请各位大侠帮我分析分析原因吧。

niwanmao

你是不是没有按照eBioscience foxP3破膜剂的使用说明做？这个kit里面应该有三个组分：eBioscience Fixation/Permeabilization Concentrate（30ml）、eBioscience Fixation/Permeabilization Diluent（100 ml）、Permeabilization Buffer (10X)
（http://www.ebioscience.com/foxp3 ... ate-and-diluent.htm、http://www.ebioscience.com/permeabilization-buffer-10x.htm）

你应该按照eBioscience 核内染色protocol的Protocol B: One-step protocol: intracellular (nuclear) proteins进行（http://media.ebioscience.com/dat ... -flow-cytometry.pdf）

mybiosciences

步骤4时间太长

Kimbryant

请问全血做跟分PBMC流程一样吗

niwanmao

Kimbryant 发表于 2014-6-17 12:44
请问全血做跟分PBMC流程一样吗

处理过程基本相似。因为有些破膜剂（如fix&Perm)第二组分有裂解红细胞作用，所以红细胞裂解（溶血）可以省略