抗体孵育时间及温度对结果的影响（再次发帖求助）

刘星宇

9月10日曾发同样的贴求助：
抗体孵育时间及温度对结果的影响
http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=2768&fromuid=15467

昨天实验发现RD公司的两种抗体可能都存在问题，做了温度比较以及时效（@didi_zhou ），受体表达的阳性百分比（与同型对照的差值）、荧光强度值（与同型对照的比值）都随着孵育时间延长、孵育温度升高（室温与4℃比较）而增高。9月底向试剂商投诉，现在等待美国RD公司的回复。

实验操作除了抗体量减半外其余均按照说明书进行，如果抗体量不够，会出现这样的情况吗？

niwanmao

差异是否有统计学差异？如果没统计学差异可能也说明不了问题吧。
另外，如果要投诉，我觉得抗体至少得足量。

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-10-20 09:39

                               
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差异是否有统计学差异？如果没统计学差异可能也说明不了问题吧。
另外，如果要投诉，我觉得抗体至少得足量 ...

温度的差异还是很明显……

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-10-21 00:02:10

                               
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温度的差异还是很明显……

各组有没有同时做同型对照？

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-10-21 07:02

                               
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各组有没有同时做同型对照？

都做了isotype control的，之前做的实验如果以空白管（unstained）设门，发现同型对照管的百分比、荧光强度也是随温度和孵育时间增加的；再以同型对照设门（1%以内），检测管也是上升的。
RD总部分析说①可能是我们的目标受体会随着孵育温度、时间上升而增加表达，建议用他们说明书推荐图中的纯单核细胞验证；②推荐加FcR block。第二点之前做过的，比较好像没有差别，而且我们的是全血标本。

月下听蝉

同样的试剂，大范围的卖出，如果只有你有这样的问题。那就很可能不是试剂本身的问题。
是否保证了自己样本细胞活率问题？不确定的话，加个死细胞标记，门掉死细胞，排除死细胞自发荧光的影响。

刘星宇

RD公司的这个试剂在国内用的人应该不多，细胞活率应该问题不大，都是刚采出来的新鲜血，而且散点图分群挺好的。
“排除死细胞自发荧光的影响”意思是孵育时间才长那么几分、十几分钟或者温度从4℃变到室温（24℃左右）死细胞增多了？

刘星宇

下图的死细胞应该是比较明显的，A门左边的一大团。当时处理是培养基1640等体积对半稀释人外周全血，放在37℃恒温箱（没有CO2）培养4h。分析应该是培养基变碱了，对细胞造成损害！