蛋白标定荧光

月下听蝉

我是做单细胞分选的。对于细胞标定的精度很严格，但孵育的蛋白又没有商业化的荧光，需要自己标定。总感觉拿自己的蛋白直接标带NHS的荧光，效果不好，信号不强，想通过带NHS荧光的二抗来放大。但始终不放心NHS类荧光置换掉lys的氨基后，真的对蛋白本身不会有很大影响吗？有没有做过系统比较的？
或者自己的重组蛋白头部 or 尾部加个tag【EVI，falg etc.】，用商品化的anti-tag的荧光抗体来放大？
有没有常做这方面的战友给点建议！多谢！

niwanmao

这个高深了，没做过。
不过似乎听说biotin标记，然后再用抗biotin的二抗检测是不是更常见？

月下听蝉

niwanmao 发表于 2013-10-23 20:38

                               
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这个高深了，没做过。
不过似乎听说biotin标记，然后再用抗biotin的二抗检测是不是更常见？ ...

biotin也都是加了NHS后再去置换蛋白里面lys的氨基。也涉及到这个问题。
1.直接标荧光
2.蛋白+二抗抗体
3.生物素化蛋白+抗生物素二抗抗体
4.蛋白带标签+抗标签二抗抗体。

我只能先全部试试再比较了。但对于NHS置换，没做过系统的测试。比较不放心。

niwanmao

月下听蝉 发表于 2013-10-23 20:54

                               
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biotin也都是加了NHS后再去置换蛋白里面lys的氨基。也涉及到这个问题。
1.直接标荧光
2.蛋白+二抗抗体

此外，现在有不少专门给蛋白直接标上荧光素的商业化kit，是否可以试试那些试剂盒？

月下听蝉

niwanmao 发表于 2013-10-23 22:02

                               
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此外，现在有不少专门给蛋白直接标上荧光素的商业化kit，是否可以试试那些试剂盒？ ...

好的。多谢！